Aktywacja bazofilów
Objawy alergiczne są spowodowane początkowym ogólnoustrojowym uwalnianiem histaminy przez aktywowane bazofile i komórki tuczne , co może prowadzić do wstrząsu z obrzękiem krtani , niedrożnością dolnych dróg oddechowych i niedociśnieniem . Z tego powodu bazofile są uważane wraz z komórkami tucznymi za kluczowe komórki w chorobach alergicznych.
Proces aktywacji
Immunoglobulina E ( IgE ) jest klasą przeciwciał (lub „izotypem”) immunoglobuliny, która została znaleziona tylko u ssaków. Odgrywa ważną rolę w alergii i jest szczególnie związany z nadwrażliwością typu 1 . Istnieją receptory (FcεR) dla regionu stałego IgE, regionu Fc , na kilku typach komórek, w tym na komórkach tucznych i bazofilach. Bazofile zawierają wiele granulek wewnątrz komórki, które są wypełnione różnorodnymi substancjami czynnymi, wywołującymi reakcję alergiczną po degranulacji. Komórki są aktywowane i rozpoczynają degranulację, gdy przeciwciało IgE związane z alergenem, który może wiązać się ze specyficznym regionem zmiennym IgE, regionem Fab , wiąże się z receptorem Fc
Metoda testu alergicznego in vitro
W większości przypadków do identyfikacji alergii stosuje się pozytywny test skórny, jednak aktywacja granulocytów zasadochłonnych anty-IgE, ekspresja antygenu CD63 na powierzchni komórki (błona plazmatyczna) pozwala na identyfikację alergenu odpowiedzialnego za reakcję nadwrażliwości bez przeprowadzania wspólnego testu zarysowania . Do tego eksperymentu potrzebna jest tylko niewielka ilość krwi, co sprawia, że jest wygodny w użyciu, ponieważ można go wykonać równolegle do normalnego badania krwi. Może być stosowany przy różnych alergiach (np. jad pszczeli , leki , środki kontrastowe ).
Degranulacja
Zdegranulowane komórki eksponują cząsteczki CD63 na ich zewnętrznej błonie komórkowej, stąd granulki , które zawierają cząsteczki CD63 na ich wewnętrznej powierzchni, połączyły się z błoną komórkową. Wewnętrzna powierzchnia komórek granulek staje się zewnętrzną powierzchnią komórek bazofila/komórki tucznej podczas procesu degranulacji.
| materiały | zamiar |
|---|---|
| BSB | stymulacja bazofilów |
| IL-3 | stymulacja bazofilów |
| alergen | |
| EDTA | korek degranulacji |
| znacznik | oznacza bazofile |
| roztwór lizy | lizuje czerwone krwinki |
| odwirować | spowolnić czerwone krwinki |
| PBS | wypłukiwanie roztworu lizy |
| FACS | liczenie komórek |
Etykietowanie i sortowanie
Ponieważ cytometria przepływowa jest cennym narzędziem do analizy dużej liczby komórek i identyfikacji populacji komórek, nawet przy niskich stężeniach, można określić odsetek bazofilów aktywowanych po stymulacji in vitro przez alergeny i wykazujących ekspresję markera CD63. Marker CD63 jest izotiocyjanianem fluoresceiny , który może wiązać się z białkiem CD63 i jest używany do sortowania komórek za pomocą FACS (sortowanie/sortowanie komórek aktywowane fluorescencją). Ten znakowany FITC antygen emituje światło o długości fali 530 nm. Ponieważ intensywność emitowanej fluorescencji jest proporcjonalna do miejsc wiązania każdej pojedynczej komórki, intensywność będzie wzrastać zgodnie z liczbą przeciwciał skoniugowanych z FITC związanych z komórkami wykazującymi ekspresję CD63.
Procedura
Przygotowuje się probówkę z buforem stymulującym bazofile (BSB) zawierającym interleukinę 3 i alergen , który ma być testowany. Dodaje się próbkę krwi i probówkę inkubuje się w temperaturze 37°C przez kilka minut, aby upewnić się, że alergeny mogą związać się z IgE. Dodanie EDTA do probówki powoduje natychmiastowe zatrzymanie procesu degranulacji. Po degranulacji do probówki dodaje się marker CD63 (znakowane przeciwciała). Kilka minut w temperaturze pokojowej daje znacznikowi czas na związanie się z białkami CD63 na błonie komórkowej bazofila. Etap lizy przeprowadza się w celu lizy krwinek czerwonych. Ponieważ znacznie przewyższają liczbę leukocytów, należy je usunąć, aby przeprowadzić analizę FACS bazofilów.