Zakłócenia CRISPR
Interferencja CRISPR ( CRISPRi ) to technika zaburzeń genetycznych, która pozwala na specyficzną dla sekwencji represję ekspresji genów w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych . Po raz pierwszy został opracowany przez Stanleya Qi i współpracowników w laboratoriach Wendella Lima , Adama Arkina, Jonathana Weissmana i Jennifer Doudna . Specyficzna dla sekwencji aktywacja ekspresji genów odnosi się do aktywacji CRISPR (CRISPRa) .
Oparta na ścieżce genetycznego układu odpornościowego bakterii – CRISPR (clustered regularnie przeplatane krótkimi powtórzeniami palindromowymi), technika ta zapewnia komplementarne podejście do interferencji RNA . Różnica między CRISPRi i RNAi polega jednak na tym, że CRISPRi reguluje ekspresję genów głównie na poziomie transkrypcji, podczas gdy RNAi kontroluje geny na poziomie mRNA.
Tło
Wiele bakterii i większość archeonów ma adaptacyjny układ odpornościowy, który zawiera geny CRISPR RNA (crRNA) i geny związane z CRISPR (cas).
Technika interferencji CRISPR (CRISPRi) została po raz pierwszy opisana przez Lei S. Qi i naukowców z University of California w San Francisco na początku 2013 r. Technologia wykorzystuje katalitycznie martwe białko Cas9 (zwykle oznaczane jako dCas9), które nie ma aktywności endonukleazy do regulacji genów w sposób kierowany przez RNA. Specyficzność kierowania jest określana przez komplementarne parowanie zasad pojedynczego kierującego RNA (sgRNA) do locus genomowego. sgRNA jest chimerycznym niekodującym RNA, który można podzielić na trzy regiony: 20-nt sekwencja parowania zasad, 42-nt spinka do włosów wiążąca dCas9 i 40-nt terminator (bakterie, drożdże, muszki owocowe, danio pręgowany, myszy).
Podczas projektowania syntetycznego sgRNA modyfikowana jest tylko 20-nt sekwencja parowania zasad. Należy również wziąć pod uwagę zmienne drugorzędowe: efekty poza celem (dla których wymagany jest prosty przebieg BLAST sekwencji parowania zasad), utrzymanie struktury szpilki do włosów wiążącej dCas9 oraz zapewnienie, że w zmodyfikowanym sgRNA nie ma miejsc restrykcyjnych, ponieważ może to stanowić problem na dalszych etapach klonowania. Ze względu na prostotę projektowania sgRNA technologia ta nadaje się do skalowania całego genomu. CRISPRi opiera się na generowaniu nieaktywnego katalitycznie Cas9. Osiąga się to poprzez wprowadzenie mutacji punktowych w dwóch resztach katalitycznych (D10A i H840A) genu kodującego Cas9. Czyniąc to, dCas9 nie jest w stanie rozszczepić dsDNA, ale zachowuje zdolność do kierowania DNA. Razem sgRNA i dCas9 stanowią minimalny system regulacji specyficznej dla genów.
Regulacja transkrypcji
Represja
CRISPRi może sterycznie tłumić transkrypcję poprzez blokowanie inicjacji lub wydłużania transkrypcji. Osiąga się to przez zaprojektowanie sgRNA komplementarnego do promotora lub sekwencji egzonowych . Poziom represji transkrypcji z celem w sekwencji kodującej jest specyficzny dla nici. W zależności od natury efektora CRISPR, nić matrycowa lub niematrycowa prowadzi do silniejszej represji. W przypadku dCas9 (opartego na systemie CRISPR typu 2) represja jest silniejsza, gdy kierujący RNA jest komplementarny do nici innej niż matryca. Sugerowano, że jest to spowodowane aktywnością helikazy, która rozwija heterodupleks RNA:DNA przed pol II RNA , gdy sgRNA jest komplementarny do nici matrycy. W przeciwieństwie do bloku wydłużania transkrypcji, wyciszanie jest niezależne od docelowej nici DNA podczas celowania w miejsce startu transkrypcji. U prokariotów to hamowanie steryczne może hamować transkrypcję docelowego genu o prawie 99,9%; u archeonów osiągnięto ponad 90% represji; w komórkach ludzkich zaobserwowano do 90% represji. U bakterii możliwe jest nasycenie celu odpowiednio wysokim poziomem kompleksu dCas9. W tym przypadku siła represji zależy tylko od prawdopodobieństwa, że dCas9 zostanie wyrzucony po zderzeniu z polimerazą RNA, co jest określone przez sekwencję kierującą. Wyższe temperatury są również związane z większym prawdopodobieństwem wyrzutu, a tym samym słabszą represją. U eukariotów CRISPRi może również tłumić transkrypcję poprzez domenę efektorową. Fuzja domeny represorowej z dCas9 umożliwia dalszą represję transkrypcji poprzez indukcję heterochromatynizacji. Na przykład dobrze zbadaną Krüppel Associated Box (KRAB) można połączyć z dCas9 w celu stłumienia transkrypcji docelowego genu do 99% w ludzkich komórkach.
Poprawa wydajności
Podczas gdy edycji genomu przez aktywną katalitycznie nukleazę Cas9 mogą towarzyszyć nieodwracalne zmiany genomowe poza celem, CRISPRi jest wysoce specyficzny z minimalnymi odwracalnymi efektami poza celem dla dwóch różnych sekwencji sgRNA. Niemniej jednak opracowano kilka metod poprawy wydajności modulacji transkrypcji. Identyfikacja miejsca startu transkrypcji genu docelowego i uwzględnienie preferencji sgRNA poprawia wydajność, podobnie jak obecność dostępnej chromatyny w miejscu docelowym.
Inne metody
Wraz z innymi wymienionymi ulepszeniami , czynniki takie jak odległość od początku transkrypcji i lokalny stan chromatyny mogą być krytycznymi parametrami w określaniu wydajności aktywacji/represji. Optymalizacja ekspresji, stabilności, lokalizacji jądrowej i interakcji dCas9 i sgRNA prawdopodobnie pozwoli na dalszą poprawę wydajności CRISPRi w komórkach ssaków.
Aplikacje
Powalenie genu
Wykazano, że znaczna część genomu (zarówno genów reporterowych, jak i endogennych) eukariontów może być celem przy użyciu konstruktów lentiwirusowych do ekspresji dCas9 i sgRNA, z wydajnością porównywalną do istniejących technik, takich jak białka RNAi i TALE. W tandemie lub jako własny system CRISPRi można wykorzystać do osiągnięcia tych samych zastosowań , co w RNAi.
W przypadku bakterii nokaut genów przez CRISPRi został w pełni wdrożony i scharakteryzowany (analiza poza celem, nieszczelna represja) zarówno dla Gram-ujemnych E. coli , jak i Gram-dodatnich B. subtilis .
Nie tylko u bakterii, ale także u archeonów (np. M. acetivorans ) CRISPRi-Cas9 został z powodzeniem wykorzystany do zablokowania kilku genów/operonów związanych z wiązaniem azotu.
serie alleliczne
Zróżnicowaną ekspresję genów można osiągnąć poprzez modyfikację wydajności parowania zasad sgRNA z docelowymi loci. Teoretycznie modulowanie tej wydajności można wykorzystać do stworzenia serii alleli dla dowolnego danego genu, w istocie tworząc kolekcję hipo- i hipermorfów. Te potężne kolekcje można wykorzystać do zbadania dowolnego badania genetycznego. W przypadku hipomorfów pozwala to na stopniową redukcję funkcji genów, w przeciwieństwie do binarnej natury knockoutów genów i nieprzewidywalności knockdownów. W przypadku hipermorfów jest to w przeciwieństwie do konwencjonalnej metody klonowania genu będącego przedmiotem zainteresowania pod promotorami o zmiennej sile.
Obrazowanie loci genomu
Fuzja białka fluorescencyjnego z dCas9 umożliwia obrazowanie loci genomowych w żywych komórkach ludzkich. W porównaniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) metoda ta w wyjątkowy sposób pozwala na dynamiczne śledzenie loci chromosomów. Zostało to wykorzystane do zbadania architektury chromatyny i dynamiki organizacji jądrowej w laboratoryjnych liniach komórkowych, w tym w komórkach HeLa.
Komórki macierzyste
Aktywacja czynników Yamanaka przez CRISPRa została wykorzystana do wywołania pluripotencji w komórkach ludzkich i mysich, zapewniając metodę alternatywną dla technologii iPS. Ponadto ekrany aktywacyjne na dużą skalę można wykorzystać do identyfikacji białek, które promują indukowaną pluripotencję lub odwrotnie, promują różnicowanie do określonej linii komórkowej.
Genetyczne badanie
Zdolność do regulacji w górę ekspresji genów za pomocą dCas9-SunTag z pojedynczym sgRNA otwiera również drzwi do ekranów genetycznych na dużą skalę, takich jak Perturb-seq , w celu odkrycia fenotypów wynikających ze zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji genów, co będzie szczególnie ważne dla zrozumienia skutki regulacji genów w raku. Ponadto wykazano, że systemy CRISPRi można przenosić poprzez poziome mechanizmy przenoszenia genów, takie jak koniugacja bakteryjna i wykazano specyficzną represję genów reporterowych w komórkach biorców. CRISPRi może służyć jako narzędzie do genetycznych badań przesiewowych i potencjalnej kontroli populacji bakterii.
Zalety i ograniczenia
Zalety
- CRISPRi może wyciszyć docelowy gen będący przedmiotem zainteresowania do 99,9% represji. Siłę represji można również dostroić, zmieniając stopień komplementarności między przewodnikiem RNA a celem. W przeciwieństwie do indukowalnych promotorów, częściowa represja przez CRISPRi nie dodaje szumu transkrypcyjnego do ekspresji docelowej. Ponieważ poziom represji jest zakodowany w sekwencji DNA, różne poziomy ekspresji można hodować we współzawodnictwie i identyfikować przez sekwencjonowanie.
- Ponieważ CRISPRi opiera się na parowaniu zasad Watsona-Cricka sgRNA-DNA i motywu NGG PAM, wybór docelowych miejsc w genomie jest prosty i elastyczny. Opracowano starannie zdefiniowane protokoły.
- Wiele sgRNA można wykorzystać nie tylko do jednoczesnej kontroli wielu różnych genów (multipleks CRISPRi), ale także do zwiększenia wydajności regulacji tego samego docelowego genu. Popularną strategią jednoczesnej ekspresji wielu sgRNA jest ułożenie sgRNA w pojedynczy konstrukt z wieloma promotorami lub elementami przetwarzającymi. Na przykład bardzo długie macierze sgRNA (ELSA) wykorzystują niepowtarzające się części, aby umożliwić bezpośrednią syntezę macierzy 12-sgRNA od dostawcy syntezy genów, mogą być bezpośrednio zintegrowane z genomem E. coli bez występowania rekombinacji homologicznej i mogą jednocześnie celować w wiele genów w celu uzyskania złożonych fenotypów.
- Chociaż te dwa systemy mogą się uzupełniać, CRISPRi zapewnia przewagę nad RNAi. Jako system egzogenny CRISPRi nie konkuruje z endogenną maszynerią, taką jak ekspresja lub funkcja mikroRNA. Ponadto, ponieważ CRISPRi działa na poziomie DNA, można celować w transkrypty, takie jak niekodujące RNA, mikroRNA, transkrypty antysensowne, RNA zlokalizowane w jądrze i transkrypty polimerazy III. Wreszcie, CRISPRi posiada znacznie większą przestrzeń sekwencji, którą można nakierować; celem mogą być również promotory i teoretycznie introny.
- W E. coli konstrukcja szczepu z nokautem genu jest niezwykle szybka i wymaga tylko jednoetapowej rekombinacji oligo .
Ograniczenia
- Wymóg sekwencji motywu sąsiadującego z protoprzerywnikiem (PAM) ogranicza liczbę potencjalnych sekwencji docelowych. Cas9 i jego homologi mogą wykorzystywać różne sekwencje PAM, a zatem teoretycznie mogłyby być wykorzystywane do zwiększania liczby potencjalnych sekwencji docelowych.
- Specyficzność sekwencji do docelowych loci ma tylko 14 nt długości (12 nt sgRNA i 2 nt PAM), co może powtórzyć się około 11 razy w ludzkim genomie. Represja jest odwrotnie skorelowana z odległością miejsca docelowego od miejsca startu transkrypcji. Prognozy obliczeniowe całego genomu lub selekcja homologów Cas9 z dłuższym PAM mogą zmniejszyć niespecyficzne kierowanie.
- Endogenne stany i modyfikacje chromatyny mogą zapobiegać specyficznemu dla sekwencji wiązaniu kompleksu dCas9-sgRNA. Poziom represji transkrypcji w komórkach ssaków różni się w zależności od genu. Potrzeba wiele pracy, aby zrozumieć rolę lokalnej konformacji DNA i chromatyny w odniesieniu do wiązania i wydajności regulacyjnej.
- CRISPRi może wpływać na geny, które znajdują się w pobliżu genu docelowego. Jest to szczególnie ważne w przypadku celowania w geny, które nakładają się na inne geny (nakładanie się sensownych lub antysensownych) lub są kierowane przez promotor dwukierunkowy.
- U eukariontów odnotowano toksyczność specyficzną dla sekwencji, przy czym niektóre sekwencje w regionie proksymalnym PAM powodują duże obciążenie sprawnościowe. Zjawisko to, zwane „efektem złego nasienia”, wciąż pozostaje niewyjaśnione, ale można je zmniejszyć, optymalizując poziom ekspresji dCas9.