Cykliczna amplifikacja nieprawidłowego fałdowania białek
Cykliczna amplifikacja nieprawidłowo sfałdowanych białek ( PMCA ) jest techniką amplifikacji (koncepcyjnie podobną do PCR , ale nie obejmującą nukleotydów ) mającą na celu zwielokrotnienie nieprawidłowo sfałdowanych prionów , pierwotnie opracowaną przez Soto i współpracowników. Jest to test na encefalopatię gąbczastą, taką jak CWD lub BSE .
Technika
W tej technice początkowo inkubuje się niewielką ilość nieprawidłowego prionu z nadmiarem normalnego białka, tak że następuje pewna konwersja. Rosnący łańcuch nieprawidłowo sfałdowanego białka jest następnie poddawany działaniu ultradźwięków , co powoduje jego rozbicie na mniejsze łańcuchy i szybkie zwiększenie ilości nieprawidłowego białka dostępnego do spowodowania konwersji. Powtarzając cykl, masa normalnego białka szybko zmienia się w badany prion. [ potrzebne źródło ]
Rozwój
PMCA został pierwotnie opracowany w celu naśladowania replikacji prionów in vitro z podobną wydajnością do procesu in vivo , ale z przyspieszoną kinetyką. PMCA jest koncepcyjnie analogiczna do reakcji łańcuchowej polimerazy - w obu systemach matryca rośnie kosztem substratu w reakcji cyklicznej, łączącej wzrost i namnażanie jednostek matrycy. [ potrzebne źródło ]
Replikacja
PMCA zastosowano do replikacji nieprawidłowo sfałdowanego białka z różnych gatunków. Nowo wytworzone białko wykazuje te same właściwości biochemiczne, biologiczne i strukturalne, co PrP Sc pochodzące z mózgu i co zaskakujące, jest zakaźne dla zwierząt typu dzikiego , powodując chorobę o podobnych cechach jak choroba wywoływana przez priony izolowane z mózgu.
Automatyzacja
Technologia została zautomatyzowana, co doprowadziło do dramatycznego wzrostu wydajności wzmocnienia. Obecnie pojedynczy cykl powoduje 2500-krotny wzrost czułości wykrywania w porównaniu z metodą Western blot, podczas gdy 2 i 7 kolejnych cykli skutkuje 6 milionami i 3 miliardami-krotnymi wzrostami czułości wykrywania w porównaniu z techniką Western blot, techniką szeroko stosowaną w BSE nadzoru w kilku krajach.
Wrażliwość
Wykazano, że PMCA jest w stanie wykryć nawet pojedynczą cząsteczkę oligomerycznego zakaźnego PrP Sc . PMCA posiada zdolność do generowania milionów jednostek zakaźnych, zaczynając od odpowiednika jednego oligomeru PrP Sc ; znacznie poniżej zakaźności . Dane te pokazują, że PMCA ma podobną moc amplifikacji jak techniki PCR stosowane do amplifikacji DNA. Otwiera to wielką szansę na rozwój wysoce czułej metody wykrywania PrP Sc oraz zrozumienie molekularnych podstaw replikacji prionów. Rzeczywiście, PMCA był stosowany przez różne grupy do PrP Sc we krwi zwierząt zakażonych eksperymentalnie prionami, zarówno w fazie objawowej, jak i przedobjawowej, jak również w moczu.
Używa
Technologia PMCA została wykorzystana przez kilka grup do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji prionów, natury czynnika zakaźnego, zjawiska szczepów prionowych i bariery gatunkowej, wpływu składników komórkowych, do wykrywania PrP Sc w tkankach i płynach biologicznych oraz w celu poszukiwania inhibitorów replikacji prionów. Niedawne badania przeprowadzone przez grupy Supattapone i Ma były w stanie wytworzyć replikację prionów in vitro za pomocą PMCA przy użyciu oczyszczonego PrP C i rekombinowanego PrP C z jedynym dodatkiem syntetycznych polianionów i lipidów . Badania te wykazały, że zakaźne priony mogą być wytwarzane w przypadku braku jakiegokolwiek innego składnika komórkowego i stanowią jeden z najsilniejszych dowodów na korzyść hipotezy prionów.
Badania przeprowadzone w 2020 r. wykazały, że cykliczną amplifikację nieprawidłowego fałdowania białek można zastosować do rozróżnienia dwóch postępujących chorób neurodegeneracyjnych, choroby Parkinsona i zaniku wieloukładowego , co stanowi pierwszy proces pozwalający na obiektywną diagnozę zaniku wieloukładowego, a nie tylko diagnozę różnicową.