Denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa
Denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (DHPLC) to metoda chromatografii służąca do wykrywania substytucji zasad, małych delecji lub insercji w DNA. Dzięki szybkości i wysokiej rozdzielczości metoda ta jest szczególnie przydatna do wykrywania polimorfizmów w DNA.
W praktyce analiza rozpoczyna się od standardowego PCR w celu amplifikacji interesującego nas fragmentu. Jeżeli amplifikowany region, który wykazuje polimorfizm(y) jest heterozygotyczny , w produkcie PCR będą obecne dwa rodzaje fragmentów odpowiadające allelowi i dzikiemu allelowi polimorficznemu. Po tym pierwszym etapie następuje etap denaturacji-renaturacji w celu utworzenia hetero- i homodupleksów z dwóch populacji alleli w PCR. Aby znaleźć homozygotyczny polimorfizm, postępuj w ten sam sposób, mieszając wstępnie dziką populację DNA z populacją polimorficznego DNA, aby uzyskać heterodupleksy po etapie denaturacji-renaturacji.
Heterodupleksy to w rzeczywistości podwójne nici DNA zawierające nić z allelu typu dzikiego i gałązkę z allelu polimorficznego. Tworzenie takich fragmentów DNA powoduje następnie pojawienie się „niedopasowania” lub złego parowania, w którym zlokalizowany jest polimorfizm.
Te „niedopasowania” w heterodupleksie są podstawą do wykrywania polimorfizmu metodą DHPLC. Heterodupleksy są mniej stabilne termicznie niż odpowiadające im homodupleksy, dlatego pojedyncze nici DNA zostaną odłączone przez chromatografię, gdy zostaną poddane działaniu wystarczająco wysokiej temperatury. Konsekwencją tej niestabilności podwójnej nici będzie niedopasowanie dwóch nici DNA w obszarze polimorfizmu, gdy DNA zostanie podgrzany do temperatury topnienia DNA . To niedopasowanie zmniejszy zatem interakcję z kolumną i spowoduje skrócenie czasu retencji w porównaniu z homodupleksami w procesie rozdziału chromatograficznego.
Do obserwacji zjawiska separacji metoda DHPLC wykorzystuje kolumnę z nieszczepioną porowatą fazą stacjonarną złożoną z polistyrenu - diwinylobenzenoalkilu . Faza stacjonarna jest elektrycznie obojętna i hydrofobowa . Jednak DNA jest naładowane ujemnie na swoich grupach fosforanowych i dlatego może adsorbować się na kolumnie. W celu umożliwienia adsorpcji stosuje się octan trietyloamonu (TEAA). Dodatnio naładowany jon amonowy tych cząsteczek oddziałuje z DNA, a łańcuch alkilowy z hydrofobową powierzchnią fazy stałej.
Dlatego, gdy heterodupleksy są częściowo zdenaturowane przez ogrzewanie, ładunki ujemne ulegają częściowemu przemieszczeniu, a siła oddziaływania między heterodupleksami DNA a kolumną maleje w porównaniu z siłą oddziaływania homodupleksów. Będą one zatem wymywane wolniej przez fazę ruchomą (składającą się z acetonitrylu ).