Epigenomika pojedynczej komórki
Epigenomika pojedynczych komórek to badanie epigenomiki (kompletu modyfikacji epigenetycznych materiału genetycznego komórki) w poszczególnych komórkach poprzez sekwencjonowanie pojedynczych komórek . Od 2013 roku stworzono metody, w tym sekwencjonowanie wodorosiarczynowe pojedynczych komórek całego genomu do pomiaru metylacji DNA , sekwencjonowanie całego genomu ChIP do pomiaru modyfikacji histonów , sekwencjonowanie całego genomu ATAC-seq do pomiaru dostępności chromatyny i przechwytywanie konformacji chromosomu .
Sekwencjonowanie metylomu pojedynczej komórki DNA
Sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki DNA określa ilościowo metylację DNA . Jest to podobne do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki, ale z dodatkiem wodorosiarczynem przed sekwencjonowaniem. Formy obejmują sekwencjonowanie wodorosiarczynem całego genomu i sekwencjonowanie wodorosiarczynem o zredukowanej reprezentacji
Jednokomórkowa sekwencja ATAC
ATAC-seq oznacza test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o dużej przepustowości. Jest to technika stosowana w biologii molekularnej do identyfikacji dostępnych regionów DNA, równoważnych z miejscami nadwrażliwymi na DNazę I. Pojedyncza komórka ATAC-seq jest wykonywana od 2015 roku przy użyciu różnych metod, od sortowania FACS , izolacji mikroprzepływowej pojedynczych komórek po indeksowanie kombinatoryczne. We wstępnych badaniach metoda była w stanie wiarygodnie rozdzielić komórki na podstawie ich typów komórek, odkryć źródła zmienności między komórkami i wykazać związek między organizacją chromatyny a zmiennością między komórkami.
Jednokomórkowy ChIP-seq
Sekwencjonowanie ChIP, znane również jako ChIP-seq, to metoda stosowana do analizy interakcji białek z DNA . ChIP-seq łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z masowo równoległym sekwencjonowaniem DNA w celu identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z DNA. W epigenomice jest to często wykorzystywane do oceny histonów (takich jak metylacja ). ChIP-seq jest również często używany do określania miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych .
Jednokomórkowe ChIP-seq jest niezwykle trudne ze względu na szum tła powodowany przez niespecyficzne obniżanie poziomu przeciwciał i jak dotąd tylko jedno badanie zakończyło się powodzeniem. W badaniu tym wykorzystano metodę mikroprzepływów opartą na kroplach, a niski zasięg wymagał sekwencjonowania tysięcy komórek w celu oceny heterogeniczności komórek.
Jednoogniwowy Hi-C
Techniki wychwytywania konformacji chromosomów (często w skrócie technologie 3C lub metody oparte na 3C) to zestaw metod biologii molekularnej stosowanych do analizy przestrzennej organizacji chromatyny w komórce. Metody te określają ilościowo liczbę interakcji między loci genomowymi, które są w pobliżu w przestrzeni trójwymiarowej, nawet jeśli loci są oddzielone wieloma kilozasadami w liniowym genomie.
Obecnie metody 3C zaczynają się od podobnego zestawu kroków, wykonywanych na próbce komórek. Po pierwsze, komórki są usieciowane , co wprowadza wiązania między białkami oraz między białkami a kwasami nukleinowymi, co skutecznie „zamraża” interakcje między genomowymi loci. Genom jest następnie cięty i trawiony na fragmenty przy użyciu enzymów restrykcyjnych . Następnie ligację opartą na bliskości , tworząc długie regiony hybrydowego DNA. Na koniec hybrydowy DNA jest sekwencjonowany w celu określenia loci genomowych, które znajdują się blisko siebie.
Single-cell Hi-C to modyfikacja oryginalnego protokołu Hi-C , będąca adaptacją metody 3C, która pozwala określić bliskość różnych regionów genomu w pojedynczej komórce. Ta metoda była możliwa dzięki przeprowadzeniu etapów trawienia i ligacji w poszczególnych jądrach, w przeciwieństwie do oryginalnego protokołu Hi-C, w którym ligację przeprowadzano po lizie komórek w puli zawierającej usieciowane kompleksy chromatyny. W pojedynczej komórce Hi-C, po ligacji, pojedyncze komórki są izolowane, a pozostałe etapy są przeprowadzane w oddzielnych przedziałach, a hybrydowy DNA jest znakowany kodem kreskowym specyficznym dla przedziału. wysokowydajne sekwencjonowanie puli hybrydowego DNA z pojedynczych komórek. Chociaż wskaźnik odzyskiwania zsekwencjonowanych interakcji (hybrydowy DNA) może wynosić zaledwie 2,5% potencjalnych interakcji, możliwe było wygenerowanie trójwymiarowych map całych genomów przy użyciu tej metody. Ponadto poczyniono postępy w analizie danych Hi-C, co umożliwiło udoskonalenie zbiorów danych HiC w celu generowania jeszcze dokładniejszych i bardziej szczegółowych map kontaktów i modeli 3D.