Interferometryczna mikroskopia rozpraszająca

Typowe konfiguracje iSCAT, w których światło odbite od szkiełka nakrywkowego (a, c) lub światło przechodzące przez próbkę (b, c) jest używane jako pole odniesienia. Sygnał można pozyskać kamerą pracującą w szerokim polu (a, b) lub detekcją punktową w układzie konfokalnym (c, d).

Interferometryczna mikroskopia rozpraszająca ( iSCAT ) odnosi się do klasy metod, które wykrywają i obrazują obiekt o długości mniejszej niż fala poprzez interferencję światła rozproszonego przez niego z referencyjnym polem świetlnym. Podstawowa fizyka jest wspólna dla innych konwencjonalnych metod interferometrycznych, takich jak kontrast fazowy lub różnicowy kontrast interferencyjny lub mikroskopia interferencyjna odbiciowa. Kluczową cechą iSCAT jest wykrywanie elastycznego rozpraszania cząstek podfalowych, znanego również jako rozpraszanie Rayleigha , oprócz sygnałów odbitych lub transmisyjnych z obiektów nadfalowych. Zazwyczaj wyzwaniem jest wykrywanie niewielkich sygnałów na dużym i złożonym tle przypominającym plamki. iSCAT był używany do badania nanocząstek, takich jak wirusy, białka, pęcherzyki lipidowe, DNA, egzosomy, nanocząstki metali, półprzewodnikowe kropki kwantowe, nośniki ładunku i pojedyncze cząsteczki organiczne bez potrzeby stosowania znacznika fluorescencyjnego.

Tło historyczne

Zasada interferencji odgrywa kluczową rolę w wielu metodach obrazowania, w tym w obrazowaniu w jasnym polu, ponieważ można ją opisać jako interferencję między polem oświetlenia a tym, które oddziałuje z obiektem, czyli poprzez wygaszenie. W rzeczywistości nawet mikroskopia oparta na interferencji z zewnętrznym polem świetlnym ma już ponad sto lat.

Pierwsze pomiary typu iSCAT przeprowadzono w środowisku biofizyków w latach 90. Systematyczny rozwój metody wykrywania nanoobiektów rozpoczął się na początku XXI wieku jako ogólny wysiłek mający na celu zbadanie opcji bez fluorescencji do badania pojedynczych cząsteczek i nanoobiektów. W szczególności nanocząsteczki złota o wielkości do 5 nm zostały zobrazowane poprzez interferencję ich rozproszonego światła z wiązką odbitą z podtrzymującego je szkiełka nakrywkowego. Wykorzystanie lasera supercontinuum dodatkowo umożliwił rejestrację widm plazmonowych cząstek. Wczesne pomiary były ograniczone resztkowym tłem przypominającym plamki. Nowe podejście do odejmowania tła i akronim iSCAT zostały wprowadzone w 2009 roku. Od tego czasu różne grupy zgłosiły szereg ważnych prac. Warto zauważyć, że dalsze innowacje w zakresie tłumienia tła i szumów doprowadziły do ​​opracowania nowych metod kwantyfikacji, takich jak fotometria masowa (pierwotnie wprowadzona jako iSCAMS), w której ultraczuła i dokładna detekcja interferometryczna jest przekształcana w ilościowy sposób pomiaru masy cząsteczkowej pojedynczych biomolekuł .

Podłoże teoretyczne

Kiedy światło odniesienia jest nałożone na światło rozproszone obiektu, intensywność na detektorze można opisać wzorem:

${\ Displaystyle I_ {det} \ propto | {\ overline {E_ {r}}} + {\ overline {E_ {s}}} | ^ { 2}=I_{r}+I_{s}+2E_{r}E_{s}\cos \phi }$

gdzie ${\ textstyle {\ overline {E_ {r}}} = E_ {r} e ^ {i \ phi _ {r}}}$ i $.$ złożonymi polami elektrycznymi odniesienia i światła Otrzymane wyrażenia to intensywność wiązki odniesienia ${\ Displaystyle (I_ {r} = | {\ overline {E_ {r}}} | ^ {2})}$ czyste rozproszone światło z obiektu ${\ Displaystyle (I_ {s} = | {\ overline {E_ {s}}} | ^ {2})}$ i przekrojowy ${\ displaystyle (2E_ {r} e_ { s}\cos \phi )}$ która zawiera fazę ${\ Displaystyle \ phi = \ phi _ {r} - \ phi _ {s}}$ . Faza ta zawiera fazy Gouya ze zmian wektorów falowych, składową fazy rozpraszania wynikającą z właściwości materiału obiektu oraz składową fazy o modulacji sinusoidalnej, która zależy od położenia cząstki.

Ogólnie rzecz biorąc, wiązka odniesienia może obierać inną ścieżkę niż światło rozproszone w układzie optycznym, o ile są one spójne i interferują z detektorem. Jednak technika staje się prostsza i bardziej stabilna, jeśli obie wiązki mają tę samą ścieżkę optyczną. Dlatego światło odbite od szkiełka nakrywkowego lub wiązka przechodząca przez próbkę jest zwykle używana jako odniesienie. Aby doszło do interferencji, konieczne jest, aby obie fale świetlne (światło rozproszone i światło odniesienia) były spójne. Co ciekawe, źródło światła o dużej długości koherencji rzędu metrów lub więcej (jak w nowoczesnych wąskopasmowych systemach laserowych) zwykle nie jest potrzebne. W najczęściej spotykanych schematach realizacji iSCAT, gdzie odniesieniem jest światło odbite od szkiełka nakrywkowego, a cząsteczka rozpraszająca znajduje się nie więcej niż kilkaset nanometrów nad szkłem, nawet „niespójne” światło, np. z diod LED, może być używany.

Aplikacje

iSCAT był używany w wielu aplikacjach. Można je z grubsza podzielić na:

Obrazowanie bez etykiet

• mikrotubule
• Nano/mikrodomeny lipidowe
• Pojedynczy zestaw wirusów
• Zależny od czasu iSCAT (StroboSCAT)

Śledzenie pojedynczych cząstek

• Śledzenie pojedynczego wirusa in vitro
• Śledzenie pojedynczego wirusa podczas wczesnej fazy infekcji w komórkach
• Mikrosekundowe śledzenie pojedynczej cząstki na żywej błonie komórkowej
• Śledzenie białek motorycznych

Wykrywanie pojedynczych cząsteczek bez znaczników, obrazowanie, śledzenie i kwantyfikacja

• Wykrywanie pojedynczych cząsteczek metodą absorpcji
• Wykrywanie pojedynczego białka
• Śledzenie pojedynczego białka
• Fotometria masowa

Śledzenie jonów

• Pojedyncze jony wchodzące/wychodzące z katody akumulatora