Klonowanie TOPO

Klonowanie z wykorzystaniem topoizomerazy (klonowanie TOPO) to technika biologii molekularnej , w której fragmenty DNA są klonowane do określonych wektorów bez konieczności stosowania ligaz DNA . Polimeraza Taq ma niezależną od matrycy aktywność transferazy końcowej, która dodaje pojedynczą deoksyadenozynę (A) do 3'-końca produktów PCR. Ta cecha jest wykorzystywana w klonowaniu TOPO TA z „lepkim końcem”. W przypadku klonowania TOPO z „tępymi końcami”, wektor biorcy nie ma nawisów i można klonować fragmenty DNA z tępymi końcami.

Zasada

Technika ta wykorzystuje naturalną aktywność biologiczną topoizomerazy DNA I. Biologiczną rolą topoizomerazy jest rozszczepianie i ponowne łączenie superskręconych końców DNA w celu ułatwienia replikacji. Topoizomeraza wirusa krowianki Specyficznie rozpoznaję sekwencję DNA 5'-(C/T)CCTT-3'. Podczas replikacji enzym trawi DNA specyficznie w tej sekwencji, rozwija DNA i ponownie liguje je z grupą fosforanową 3' zasady tymidyny .

Wektory w dostępnych na rynku zestawach TOPO zostały dodane do miejsca topoizomerazy osadzonego w kasecie beta-galaktozydazy, umożliwiając skanowanie niebiesko-białe. W ten sposób końce wektora samoorganizują się, co powoduje wytwarzanie niebieskich kolonii, których nie trzeba selekcjonować i sekwencjonować pod kątem potencjalnie pozytywnych klonów.

Klonowanie TOPO TA „lepki koniec”.

Wektory TOPO są zaprojektowane w taki sposób, że niosą tę specyficzną sekwencję 5'-(C/T)CCTT-3' na dwóch liniowych końcach. DNA wektora liniowego ma już enzym topoizomerazę kowalencyjnie przyłączoną do obu jego wolnych końców 3' nici. To jest następnie mieszane z produktami PCR. Kiedy wolne końce 5' nici produktu PCR przyczepiają się do końca 3' topoizomerazy każdej nici wektora, nici są połączone kowalencyjnie przez już związaną topoizomerazę. Ta reakcja przebiega wydajnie, gdy ten roztwór inkubuje się w temperaturze pokojowej z wymaganą solą. Do klonowania fragmentów amplifikowanych przez polimerazę Taq lub Pfu stosuje się różne typy wektorów, ponieważ polimeraza Taq (w przeciwieństwie do Pfu) pozostawia podczas amplifikacji dodatkowy nukleotyd „A” na końcu 3'.

Technika klonowania TA TOPO opiera się na zdolności adeniny (A) i tyminy (T) (komplementarnych par zasad) na różnych fragmentach DNA do hybrydyzacji i ligacji w obecności ligazy lub topoizomerazy. Wstawka jest tworzona przez PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq, polimerazy, która nie ma aktywności sprawdzającej od 3' do 5' iz dużym prawdopodobieństwem dodaje pojedynczy wystający fragment 3'-adeninowy na każdym końcu produktu PCR. Najlepiej, jeśli startery PCR mają guaniny na końcu 5', ponieważ maksymalizuje to prawdopodobieństwo, że polimeraza Taq DNA doda końcowy wystający fragment adenozyny. Nie należy stosować termostabilnych polimeraz zawierających ekstensywną aktywność egzonukleazy 3' do 5', ponieważ nie pozostawiają one nawisów adeninowych 3'. Wektor docelowy jest linearyzowany i cięty enzymem restrykcyjnym o tępych końcach. Ten wektor jest następnie łączony trifosforanem dideoksytymidyny (ddTTP) przy użyciu terminalnej transferazy. Ważne jest, aby użyć ddTTP, aby zapewnić dodanie tylko jednej reszty T. To ogonowanie pozostawia wektor z pojedynczą wystającą 3' resztą tyminy na każdym tępym końcu.

Klonowanie TOPO „tępym końcem”.

Do klonowania TOPO można również zastosować polimerazy (takie jak Phusion) lub enzymy restrykcyjne, które wytwarzają tępe końce. Zamiast polegać na lepkich końcach, tępy koniec wektora TOPO ma tępe końce, w których są związane cząsteczki topoizomerazy. Dostępne są komercyjne zestawy, takie jak Zero Blunt® Cloning Kit firmy Invitrogen.