Krystalografia racemiczna
Krystalografia racemiczna to technika stosowana w biologii strukturalnej , w której kryształy cząsteczki białka powstają z równomolowej mieszaniny cząsteczki białka L o naturalnej chiralności i jej lustrzanego odbicia białka D. Cząsteczki białka L składają się z „lewoskrętnych” L- aminokwasów i achiralnego aminokwasu glicyny, podczas gdy lustrzane odbicie cząsteczek białka D składa się z „prawoskrętnych” D-aminokwasów i glicyny. Zazwyczaj zarówno białko L, jak i białko D są przygotowywane na drodze całkowitej syntezy chemicznej.
Produkcja
Natywna ligacja chemiczna niezabezpieczonych segmentów peptydowych jest stosowana do przygotowania łańcucha polipeptydowego białka, który jest następnie fałdowany w celu utworzenia cząsteczki białka. W natywnej ligacji chemicznej C-końcowy tioester peptydu reaguje z drugim peptydem, który ma resztę cysteiny na swoim N-końcu, dając produkt z wiązaniem peptydowym w miejscu ligacji. Wiele niezabezpieczonych segmentów peptydowych można połączyć w ten sposób, aby uzyskać łańcuch polipeptydowy o pełnej długości, który jest sfałdowany, dając docelową cząsteczkę białka. Po osiągnięciu chemicznej syntezy białka L, enancjomer białka D można wytworzyć przy użyciu syntetycznych bloków budulcowych peptydów wykonanych z D-aminokwasów i Gly. Synteza zbieżna jest najskuteczniejsza w przygotowywaniu długich łańcuchów polipeptydowych przy użyciu hydrazydów peptydowych, gdzie hydrazyd można przekształcić w tioester do zastosowania w natywnej ligacji chemicznej. Hydrazyd jest stabilny w natywnych warunkach reakcji ligacji chemicznej i może być przekształcony in situ w reaktywny tioester peptydowy do następnej natywnej reakcji kondensacji ligacji chemicznej.
Teoria
Istnieje tylko 230 różnych sposobów układania obiektów w regularne trójwymiarowe tablice. W krystalografii molekularnej układy te nazywane są „grupami przestrzennymi”. Jednak tylko 65 z tych układów jest dostępnych dla obiektów chiralnych lub cząsteczek chiralnych. Pozostałe 165 grup przestrzennych zawiera środek symetrii lub płaszczyznę lustrzaną, a zatem nie są dostępne dla naturalnych białek kulistych, które są cząsteczkami chiralnymi. Wukowitz i Yeates opracowali teorię matematyczną, aby wyjaśnić preferencje kulistych białek do krystalizacji w określonych grupach przestrzennych. Zasugerowali, że preferowana grupa przestrzenna została określona przez liczbę stopni swobody (D) lub wymiarowość jako miarę łatwości, z jaką można utworzyć daną symetrię. Przeanalizowali liczbę stopni swobody zarówno dla chiralnych, jak i achiralnych grup przestrzennych, gdzie stwierdzono, że grupa przestrzenna P1(bar) z D=8 jest teoretycznie najbardziej dominującą grupą przestrzenną. Ponieważ achiralna grupa przestrzenna miała wyższy stopień swobody w porównaniu z chiralnymi grupami przestrzennymi, przewidzieli, że racemiczne mieszaniny enancjomerów białkowych będą krystalizować łatwiej w porównaniu z samymi naturalnymi białkami L, tworząc achiralne {L-białko plus D-białko } par. Chociaż najbardziej korzystna jest grupa przestrzenna P1(bar), bardzo korzystne są również grupy P21/c i C2/c, podczas gdy oczekuje się, że inne achiralne grupy przestrzenne będą pojawiać się rzadziej. Dlatego P1 (bar), P21/c i C2/c są uważane za wspólne centrosymetryczne grupy przestrzenne w mieszaninach racemicznych.
Rozwój i aplikacje
Historia
W 1989 roku Alan Mackay zasugerował, że gdyby można było zastosować syntezę chemiczną do wytworzenia enancjomerów białka L i D, umożliwiłoby to użycie mieszanin racemicznych do krystalizacji białek w centrosymetrycznych grupach przestrzennych. Stwierdził, że ponieważ w danych dyfrakcji rentgenowskiej uzyskanych z kryształu centrosymetrycznego fazy pozadiagonalne zniosłyby, dając fazy różniące się o 180 stopni, ułatwiłoby to rozwiązanie problemu fazowego w określaniu struktury białek za pomocą krystalografii rentgenowskiej.
W 1993 roku Laura Zawadzke i Jeremy Berg po raz pierwszy użyli małego (45 aminokwasów) białka rubredoksyny do zsyntetyzowania go w postaci racemicznej. Zrobiono to, ponieważ określenie struktury byłoby potencjalnie łatwiejsze i bardziej niezawodne przy użyciu danych dyfrakcyjnych z centrosymetrycznego kryształu, który wymaga wzrostu z mieszaniny racemicznej . Mając środek symetrii utworzony przez pary racemicznych białek, etapy dyfrakcji fazowej w analizie danych zostałyby jeszcze bardziej uproszczone. Jak wspomniano powyżej, w 1995 roku Stephanie Wukovitz i Todd Yeates opracowali teorię matematyczną wyjaśniającą, dlaczego cząsteczki białek mają tendencję do częstszej krystalizacji w pewnych grupach przestrzennych niż w innych; przewidzieli, że najbardziej uprzywilejowaną grupą przestrzenną białek będzie P1<słupek> i przewidzieli, że globularne białka będą łatwiej krystalizować jako racematy z racemicznej mieszaniny białek.
Godne uwagi aplikacje
Wraz z rozwojem natywnej ligacji chemicznej w 1994 r. Możliwa stała się całkowita synteza chemiczna par enancjomerów białka D i białka L. W pierwszym praktycznym zastosowaniu do rozwiązania nieznanej struktury zastosowano racemiczną i quasi-racemiczną krystalografię rentgenowską do określenia struktury białka przeciw zamarzaniu pchły śnieżnej. W trakcie tych prac zaobserwowano, że racemiczne, a nawet quasi-racemiczne mieszaniny białek znacznie ułatwiają tworzenie kryształów o jakości dyfrakcyjnej, centrosymetrycznych. Quasi-racematy są tworzone przez lustrzane odbicie cząsteczek białek, które nie są prawdziwymi enancjomerami, ale które są wystarczająco podobnymi obiektami w lustrzanym odbiciu, aby utworzyć uporządkowane pseudo-centrosymetryczne macierze.
Następnie wykazano, że pary racemicznych i quasi-racemicznych cząsteczek białek przygotowanych przez całkowitą syntezę chemiczną radykalnie zwiększają szybkość tworzenia kryształów o jakości dyfrakcyjnej z szerokiego zakresu kulistych cząsteczek białek.
Rv1738, białko Mycobacterium tuberculosis , jest produktem genu o największej regulacji w górę, gdy M. tb wchodzi w trwały stan uśpienia. Preparaty rekombinacyjnie eksprymowanego białka L Rv1738 opierały się szeroko zakrojonym próbom tworzenia kryształów. Mieszanina racemiczna chemicznie zsyntetyzowanych form białka D i białka L Rv1738 dała kryształy w centrosymetrycznej grupie przestrzennej C2/c. Struktura, zawierająca dimery białka L i D w centrosymetrycznej grupie przestrzennej, wykazała strukturalne podobieństwo do "czynników sprzyjających hibernacji", które mogą wiązać się z rybosomami i tłumić translację.
Krystalizację białka ubikwityny przeprowadzono z powodzeniem za pomocą krystalografii racemicznej. Krystalizacja samej D-ubikwityny lub L-ubikwityny jest trudna, podczas gdy racemiczna mieszanina D-ubikwityny i L-ubikwityny łatwo krystalizowała, a kryształy o jakości dyfrakcyjnej otrzymywano przez noc w prawie połowie warunków testowanych na standardowym komercyjnym ekranie krystalizacyjnym.
Krystalizację racematów cząsteczek mikroprotein zawierających disiarczki wykorzystano do określenia struktury inhibitora trypsyny SFTI-1 (14 aminokwasów, 1 disiarczek), konotoksyny cVc1.1 (22 aminokwasy, 2 disiarczki) oraz cyklotydu kB1 (29 aminokwasów kwasy, 3 disiarczki). Za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej stwierdzono, że racematy krystalizowały w centrosymetrycznych grupach przestrzennych P3(bar), Pbca i P1(bar).
Co ciekawe, stwierdzono, że achiralne łańcuchy „peptydowe” fałdują się jako pary racemiczne i krystalizują w wysoce preferowanych centrosymetrycznych grupach przestrzennych.
Struktura krystaliczna o wysokiej rozdzielczości racematu heterochiralnego kompleksu białka D z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A). Lustrzane odbicie formy D-białka VEGF-A zastosowano w prezentacji fagowej w celu zidentyfikowania 56-resztowego białka wiążącego L o powinowactwie nanomolowym; chemicznie zsyntetyzowany środek wiążący białko D miał takie samo powinowactwo do formy L-białka VEGF-A. Mieszanina chemicznie zsyntetyzowanych białek składających się z D-VEGF-A, L-VEGF-A i po dwa równoważniki każdego z substancji wiążącej białko D i L-białkowej dała racemiczne kryształy w centrosymetrycznej grupie przestrzennej P21/n. Strukturę tego heterochiralnego kompleksu białkowego o masie cząsteczkowej 71 kDa rozwiązano z rozdzielczością 1,6 Å