Liposomy jednowarstwowe
Liposom jednowarstwowy to kulisty liposom , pęcherzyk , ograniczony pojedynczą dwuwarstwą amfifilowego lipidu lub mieszaniny takich lipidów, zawierający wodny roztwór wewnątrz komory. Liposomy jednowarstwowe są używane do badania układów biologicznych i naśladowania błon komórkowych i są podzielone na trzy grupy w zależności od ich wielkości: małe jednowarstwowe liposomy/pęcherzyki (SUV), które mają zakres wielkości 20–100 nm, duże jednowarstwowe liposomy/pęcherzyki ( LUV) o wielkości w zakresie 100–1000 nm oraz gigantyczne jednowarstwowe liposomy/pęcherzyki (GUV) o wielkości w zakresie 1–200 µm. GUV są najczęściej używane jako modele błon biologicznych w pracach badawczych. Komórki zwierzęce mają 10–30 µm, a komórki roślinne mają zazwyczaj 10–100 µm. Nawet mniejsze organelle komórkowe, takie jak mitochondria, mają typowo 1-2 µm. Dlatego odpowiedni model powinien uwzględniać wielkość badanej próbki. Ponadto wielkość pęcherzyków dyktuje ich krzywizny błony , która jest ważnym czynnikiem w badaniu białek fuzyjnych. SUV mają wyższą krzywiznę błony, a pęcherzyki o dużej krzywiźnie błony mogą sprzyjać fuzji błony szybciej niż pęcherzyki o niższej krzywiźnie błony, takie jak GUV.
Skład i właściwości błony komórkowej różnią się w różnych komórkach (komórkach roślinnych, komórkach ssaków, komórkach bakteryjnych itp.). W dwuwarstwie membrany często skład fosfolipidów różni się między listkami wewnętrznymi i zewnętrznymi. Fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloinozytol i sfingomielina to jedne z najczęstszych lipidów większości błon komórkowych zwierząt. Te lipidy są bardzo różne pod względem ładunku, długości i stanu nasycenia. Na przykład obecność wiązań nienasyconych (wiązanie podwójne) w lipidach powoduje załamanie łańcuchów acylowych, co dodatkowo zmienia upakowanie lipidów i powoduje luźniejsze upakowanie. Dlatego skład i rozmiary jednowarstwowych liposomów muszą być starannie dobrane w zależności od przedmiotu badania.
Każda dwuwarstwowa struktura lipidowa jest ogólnie porównywalna z organizacją lipidów fazy lamelarnej w błonach biologicznych . W przeciwieństwie do tego, liposomy wielowarstwowe (MLV) składają się z wielu koncentrycznych amfifilowych dwuwarstw lipidowych, analogicznych do warstw cebuli, a MLV mogą mieć różne rozmiary do kilku mikrometrów.
Przygotowanie
Małe pęcherzyki jednowarstwowe i duże pęcherzyki jednowarstwowe
Istnieje kilka metod przygotowania jednowarstwowych liposomów, a protokoły różnią się w zależności od rodzaju pożądanych jednowarstwowych pęcherzyków. Różne lipidy można kupić albo rozpuszczone w chloroformie , albo w postaci liofilizowanych lipidów. W przypadku lipidów liofilizowanych można je rozpuścić w chloroformie. Następnie lipidy miesza się w pożądanym stosunku molowym. Następnie chloroform odparowuje się delikatnym strumieniem azotu (aby uniknąć kontaktu z tlenem i utleniania lipidów) w temperaturze pokojowej. Parownik obrotowy można wykorzystać do utworzenia jednorodnej warstwy liposomów. Ten krok usuwa większość chloroformu. Aby usunąć pozostałości uwięzionego chloroformu, lipidy umieszcza się pod próżnią na kilka godzin do nocy. Kolejnym etapem jest ponowne uwodnienie, podczas którego wysuszone lipidy są ponownie zawieszane w żądanym buforze. Lipidy można wirować przez kilka minut, aby upewnić się, że wszystkie pozostałości lipidów zostaną ponownie zawieszone. SUV-y można zdobyć na dwa sposoby. Albo przez sonikację (na przykład za pomocą 1-sekundowych impulsów w cyklach 3 Hz przy mocy 150 W) lub przez wytłaczanie. W metodzie wytłaczania mieszaninę lipidów przepuszcza się przez membranę 10 lub więcej razy. W zależności od rozmiaru membrany można uzyskać SUV lub LUV. Trzymanie pęcherzyków pod argonem, z dala od tlenu i światła może wydłużyć ich żywotność.
Olbrzymie Jednowarstwowe Pęcherzyki
Naturalne pęcznienie: w tej metodzie lipidy rozpuszczalne w chloroformie są nanoszone pipetą na teflonowy pierścień. Pozwolono na odparowanie chloroformu, po czym pierścień umieszczono pod próżnią na kilka godzin. Następnie wodny bufor delikatnie dodaje się na pierścień teflonowy i pozwala się lipidom naturalnie pęcznieć, tworząc GUV przez noc. wadą tej metody jest to, że tworzy się duża ilość wielowarstwowych pęcherzyków i resztek lipidów.
Elektroformowanie: W tej metodzie lipidy umieszcza się na przewodzącym szkle nakrywkowym (szkło powlekane tlenkiem indowo-cynowym lub ITO) lub na przewodach Pt zamiast pierścienia teflonowego, a po odkurzeniu bufor umieszcza się na wysuszonych lipidach i umieszcza za pomocą drugiego przewodzącego szklana pokrywa. Następnie przykładane jest pole elektryczne o określonej częstotliwości i napięciu, które sprzyja tworzeniu się GUV. W przypadku lipidów wielonienasyconych technika ta może wywołać znaczny efekt utleniania pęcherzyków. Niemniej jednak jest to bardzo powszechna i niezawodna technika generowania GUV. Istnieją zmodyfikowane podejścia, które wykorzystują pęcznienie wspomagane żelem (pęcznienie wspomagane agarozą lub pęcznienie wspomagane PVA) do tworzenia GUV w bardziej istotnych biologicznie warunkach.
Istnieje wiele metod zamykania reagentów biologicznych w GUV za pomocą interfejsów woda-olej jako rusztowania do składania warstw lipidowych. Pozwala to na użycie GUV jako podobnych do komórek pojemników membranowych do odtwarzania (i badania) funkcji biologicznych in vitro. Te metody kapsułkowania obejmują metody mikroprzepływowe, które pozwalają na wysokowydajne wytwarzanie pęcherzyków o stałych rozmiarach.
Aplikacje
Liposomy fosfolipidowe są stosowane jako ukierunkowane systemy dostarczania leków . Leki hydrofilowe mogą być przenoszone jako roztwór wewnątrz SUV-ów lub MLV, a leki hydrofobowe mogą być włączane do dwuwarstwy lipidowej tych liposomów. W przypadku wstrzyknięcia do krążenia ludzkiego/zwierzęcego ciała, MLV są preferencyjnie pobierane przez komórki fagocytujące , a zatem leki mogą być kierowane do tych komórek. W przypadku dostawy ogólnej lub całościowej można użyć SUV-ów. Do stosowania miejscowego na skórę, specjalistyczne lipidy, takie jak fosfolipidy i sfingolipidy mogą być stosowane do wytwarzania liposomów wolnych od leków jako środki nawilżające oraz z lekami, takimi jak do zastosowań przeciw promieniowaniu ultrafioletowemu.
W badaniach biomedycznych liposomy jednowarstwowe są niezwykle przydatne do badania systemów biologicznych i naśladowania funkcji komórek. Ponieważ badanie żywej komórki jest bardzo skomplikowane, liposomy jednowarstwowe stanowią proste narzędzie do badania interakcji błonowych, takich jak fuzja błonowa , lokalizacja białek w błonie plazmatycznej, badanie kanałów jonowych itp.