Mikrobiologia impedancyjna
Mikrobiologia impedancyjna to technika mikrobiologiczna stosowana do pomiaru gęstości liczby drobnoustrojów (głównie bakterii , ale także drożdży ) w próbce poprzez monitorowanie parametrów elektrycznych pożywki . Zdolność metabolizmu drobnoustrojów do zmiany przewodnictwa elektrycznego pożywki została odkryta przez Stewarta i dalej badana przez innych naukowców, takich jak Oker-Blom, Parson i Allison w pierwszej połowie XX wieku. Jednak dopiero pod koniec lat 70. dzięki komputerowo systemów służących do monitorowania impedancji , technika ta ujawniła swój pełny potencjał, co omówiono w pracach Fistenberg-Eden & Eden, Ur & Brown i Cady.
Zasada działania
Gdy para elektrod jest zanurzona w pożywce wzrostowej, układ składający się z elektrod i elektrolitu można modelować za pomocą obwodu elektrycznego z rys. 1, gdzie Rm i Cm są rezystancją i pojemnością pożywki objętościowej, natomiast R i a Ci to rezystancja i pojemność międzyfazowa elektroda-elektrolit. Jednak gdy częstotliwość sinusoidalna sygnał testowy przyłożony do elektrod jest stosunkowo niski (poniżej 1 MHz), pojemność objętościową Cm można pominąć i można modelować układ z prostszym obwodem składającym się tylko z rezystancji R s i pojemności C s połączonych szeregowo. Rezystancja Rs odpowiada za przewodnictwo elektryczne ośrodka masowego, podczas gdy pojemność Cs wynika z pojemnościowej podwójnej warstwy na granicy faz elektroda-elektrolit. Podczas fazy wzrostu metabolizm bakterii przekształca nienaładowane lub słabo naładowane związki pożywki w silnie naładowane związki, które zmieniają właściwości elektryczne pożywki. Powoduje to spadek rezystancji R s i wzrost pojemności C s .
0 W technice mikrobiologii impedancyjnej działa to w ten sposób, że próbkę o początkowym nieznanym stężeniu bakterii (C ) umieszcza się w temperaturze sprzyjającej wzrostowi bakterii (w zakresie od 37 do 42 ° C, jeśli celem jest populacja drobnoustrojów mezofilnych) i parametrom elektrycznym R s i Cs są mierzone w regularnych odstępach czasu kilku minut za pomocą kilku elektrod w bezpośrednim kontakcie z próbką. [ potrzebne źródło ]
Dopóki stężenie bakterii nie spadnie poniżej krytycznej wartości progowej CTH, parametry elektryczne Rs i Cs pozostają zasadniczo stałe (w wartościach wyjściowych). CTH zależy od różnych parametrów, takich jak geometria elektrody, szczep bakteryjny, skład chemiczny pożywki itp., ale zawsze mieści się w przedziale 10 6 do 10 7 jtk/ml.
Gdy stężenie bakterii wzrasta powyżej C TH , parametry elektryczne odbiegają od wartości wyjściowych (generalnie w przypadku bakterii następuje spadek R s i wzrost C s , u drożdży sytuacja jest odwrotna).
0 Czas potrzebny do odchylenia parametrów elektrycznych R s i C s od ich wartości bazowych jest określany jako czas detekcji (DT) i jest parametrem używanym do oszacowania początkowego nieznanego stężenia bakterii C .
0 Na fig. 2 wykreślono typową krzywą dla Rs, jak również odpowiednie stężenie bakterii w funkcji czasu. Ryc. 3 przedstawia typowe krzywe Rs w funkcji czasu dla próbek charakteryzujących się różnym stężeniem bakterii. Ponieważ DT jest czasem potrzebnym do wzrostu stężenia bakterii od wartości początkowej C do C TH , próbki silnie zanieczyszczone charakteryzują się niższymi wartościami DT niż próbki o niskim stężeniu bakterii. Biorąc pod uwagę C 1 , C 2 i C 3 stężenie bakterii w trzech próbkach z C 1 > C 0 2 > C 3 , to jest ID 1 < ID 2 < ID 3 . Dane z literatury pokazują, że DT jest funkcją liniową logarytmu C :
gdzie parametry A i B są zależne od konkretnego typu badanych próbek, szczepów bakteryjnych, rodzaju użytej pożywki wzbogacającej i tak dalej. Parametry te można obliczyć, kalibrując system przy użyciu zestawu próbek, w których stężenie bakterii jest znane, i obliczając linię regresji liniowej, która zostanie wykorzystana do oszacowania stężenia bakterii na podstawie zmierzonego DT.
Mikrobiologia impedancyjna ma różne zalety w porównaniu ze standardową techniką liczenia na płytce do pomiaru stężenia bakterii. Charakteryzuje się szybszym czasem reakcji. W przypadku bakterii mezofilnych czas odpowiedzi waha się od 2 – 3 godzin dla próbek silnie zanieczyszczonych (10 5 - 10 6 jtk/ml) do ponad 10 godzin dla próbek o bardzo niskim stężeniu bakterii (poniżej 10 jtk/ml). Dla porównania, dla tych samych szczepów bakterii technika Plate Count charakteryzuje się czasami odpowiedzi od 48 do 72 godzin. [ potrzebne źródło ]
Mikrobiologia impedancyjna to metoda, którą można łatwo zautomatyzować i wdrożyć jako część maszyny przemysłowej lub zrealizować jako wbudowany przenośny czujnik, podczas gdy liczenie płytek jest metodą ręczną, która musi być wykonywana w laboratorium przez długo wyszkolony personel.
Oprzyrządowanie
W ciągu ostatnich dziesięcioleci zbudowano różne instrumenty (zarówno laboratoryjne, jak i dostępne na rynku) do pomiaru stężenia bakterii przy użyciu mikrobiologii impedancyjnej. Jednym z najlepiej sprzedających się i dobrze akceptowanych przyrządów w branży jest Bactometer firmy Biomerieux. Oryginalny instrument z 1984 roku posiada system wielu inkubatorów, który może monitorować do 512 próbek jednocześnie z możliwością ustawienia 8 różnych temperatur inkubacji. Inne instrumenty o wydajności porównywalnej z Bactometer to Malthus firmy Malthus Instruments Ltd (Bury, Wielka Brytania), RABIT firmy Don Whitley Scientific (Shipley, Wielka Brytania) i Bac Trac firmy Sy-Lab (Purkensdorf, Austria). Niedawno zaproponowano przenośny wbudowany system do pomiaru stężenia drobnoustrojów w płynnych i półpłynnych mediach z wykorzystaniem mikrobiologii impedancyjnej. System składa się z termoregulowanej komory inkubacyjnej, w której przechowywana jest badana próbka oraz sterownika do pomiarów termoregulacji i impedancji.
Aplikacje
Mikrobiologia impedancyjna była szeroko stosowana w ostatnich dziesięcioleciach do pomiaru stężenia bakterii i drożdży w różnego rodzaju próbkach, głównie w celu zapewnienia jakości w przemyśle spożywczym. Niektóre zastosowania to określanie okresu przydatności do spożycia pasteryzowanego mleka i pomiar całkowitego stężenia bakterii w surowym mleku, mrożonych warzywach, produktach zbożowych, produktach mięsnych i piwie. Technika ta została również wykorzystana w monitorowaniu środowiska do wykrywania stężenia bakterii z grupy coli w próbkach wody, a także innych patogenów bakteryjnych, takich jak E. coli obecnych w zbiornikach wodnych, w przemyśle farmaceutycznym do testowania skuteczności nowych środków przeciwbakteryjnych i testowania produktów końcowych.