Mikroskopia arkuszy świetlnych z oświetleniem strukturalnym

Mikroskopia arkuszy świetlnych z oświetleniem strukturalnym (SI-LSM) to technika obrazowania optycznego stosowana do uzyskiwania obrazowania wolumetrycznego z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną we wszystkich trzech wymiarach. Łączy w sobie zdolność mikroskopii arkuszy świetlnych do utrzymania rozdzielczości przestrzennej w stosunkowo grubych próbkach z wyższą rozdzielczością osiową i przestrzenną charakterystyczną dla mikroskopii z oświetleniem strukturalnym. SI-LSM może osiągnąć rozdzielczość boczną poniżej 100 nm w próbkach biologicznych o grubości setek mikrometrów.

SI-LSM jest najczęściej używany do obrazowania fluorescencyjnego żywych próbek biologicznych, takich jak hodowle komórkowe. Jest to szczególnie przydatne w badaniach podłużnych, w których obrazowanie z dużą szybkością musi być wykonywane przez długi czas bez uszkodzenia próbki. Dwie metody najczęściej stosowane do obrazowania fluorescencyjnego próbek 3D – mikroskopia konfokalna i mikroskopia szerokokątna – oba mają istotne wady dla tego typu zastosowań. W mikroskopii szerokokątnej zarówno skupione światło z badanej płaszczyzny, jak i nieostre światło z reszty próbki są zbierane razem, tworząc „problem brakującego stożka”, który utrudnia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Chociaż mikroskopia konfokalna w dużej mierze rozwiązuje ten problem, wykorzystując otworek do blokowania nieskupionego światła, technika ta nieuchronnie blokuje również użyteczny sygnał, co jest szczególnie szkodliwe w obrazowaniu fluorescencyjnym, gdy sygnał jest już bardzo słaby. Ponadto zarówno mikroskopia szerokokątna, jak i konfokalna oświetlają całą próbkę podczas obrazowania, co prowadzi do problemów z fotowybielanie i fototoksyczność w niektórych próbkach. Chociaż sama mikroskopia w polu świetlnym może rozwiązać większość tych problemów, jej osiągnięta rozdzielczość jest nadal zasadniczo ograniczona przez dyfrakcję światła i nie jest w stanie osiągnąć superrozdzielczości .

SI-LSM działa przy użyciu wzorzystego, a nie jednolitego arkusza światła do oświetlania pojedynczej płaszczyzny obrazowanej objętości. W ten sposób zachowuje wiele zalet mikroskopii arkuszy świetlnych, jednocześnie osiągając wysoką rozdzielczość mikroskopii z oświetleniem strukturalnym.

Tło i teoria

Teorię stojącą za SI-LSM można najlepiej zrozumieć, rozważając osobny rozwój mikroskopii oświetlenia strukturalnego i mikroskopii arkuszy świetlnych.

Strukturalna mikroskopia iluminacyjna

efekt mory

Strukturalna mikroskopia oświetleniowa (SIM) to metoda mikroskopii w super rozdzielczości, która jest wykonywana poprzez pozyskiwanie wielu obrazów tej samej próbki przy różnych wzorach oświetlenia, a następnie obliczeniowe łączenie tych obrazów w celu uzyskania pojedynczej rekonstrukcji z nawet 2-krotną poprawą w stosunku do ograniczonej dyfrakcji rozdzielczość boczna. Teoria została po raz pierwszy zaproponowana i wdrożona w artykule Johna M. Guerry z 1995 roku, w którym krzemowa siatka z liniami i przestrzeniami 50 nm została rozdzielona za pomocą oświetlenia o długości fali 650 nm (w powietrzu) ​​zorganizowanego przez przezroczystą replikę w pobliżu wspomnianej siatki. Nazwa „mikroskopia z oświetleniem strukturalnym” została wymyślona w 2000 roku przez MGL Gustafssona. SIM wykorzystuje „ mory ”, który występuje, gdy dwa wzory są multiplikatywnie nakładane. Nałożenie powoduje pojawienie się „Moiré Fringes”, które są bardziej płynne niż którykolwiek z oryginalnych wzorów, ale nadal zawierają informacje o wzorach o wysokiej częstotliwości, które w innym przypadku nie byłyby widoczne.

Teorię stojącą za SIM najlepiej zrozumieć w dziedzinie Fouriera lub w domenie częstotliwości . Ogólnie rzecz biorąc, systemy obrazowania mogą rozróżnić tylko częstotliwości poniżej granicy dyfrakcji . Zatem w domenie Fouriera wszystkie zarejestrowane częstotliwości ze zobrazowanej próbki znajdowałyby się w okręgu o stałym promieniu. Wszelkie częstotliwości poza tym limitem nie mogą zostać rozwiązane. Jednak widmo częstotliwości można przesunąć, obrazując próbkę za pomocą wzorzystego oświetlenia. Najczęściej wzór jest sinusoidalnym gradientem 1D, takim jak wzór użyty do utworzenia prążków mory na powyższym obrazie. Ponieważ transformata Fouriera sinusoidy jest przesuniętą funkcją delta , transformacja tego wzorca będzie składać się z trzech funkcji delta: jednej przy częstotliwości zerowej i dwóch odpowiadających składowej dodatniej i ujemnej częstotliwości sinusoidy (patrz ilustracja poniżej). Kiedy cel jest oświetlany za pomocą tego wzoru, cel i wzór oświetlenia są multiplikatywnie nakładane, co oznacza, że ​​transformata Fouriera wynikowego obrazu jest splotem poszczególnych transformat celu i wzoru oświetlenia. Splot dowolnej funkcji z funkcją delta powoduje przesunięcie środka oryginalnej funkcji do położenia funkcji delta. Zatem w tej sytuacji widmo częstotliwości celu jest przesunięte, a częstotliwości, które wcześniej były zbyt wysokie, aby je rozróżnić, teraz mieszczą się w kręgu częstotliwości możliwych do rozdzielenia. W rezultacie w przypadku pojedynczej akwizycji obrazu za pomocą karty SIM wszystkie składowe częstotliwości z trzech oddzielnych obszarów w domenie Fouriera (odpowiadające środkowi oraz przesunięciom dodatnim i ujemnym) są rejestrowane razem. Wreszcie, ponieważ obrót w domenie przestrzennej skutkuje tym samym obrotem w domenie Fouriera, wysokie częstotliwości w całym zakresie 360° można uchwycić, obracając wzór oświetlenia. Rysunek b) na poniższym obrazie pokazuje, które składowe częstotliwości zostałyby przechwycone przez wykonanie 4 oddzielnych obrazów i obrócenie wzoru oświetlenia o 45° pomiędzy poszczególnymi akwizycjami.

Po przechwyceniu wszystkich obrazów pojedynczy obraz końcowy można zrekonstruować obliczeniowo. Dzięki tej technice rozdzielczość można zwiększyć nawet dwukrotnie w stosunku do granicy dyfrakcji. To ograniczenie 2x jest narzucone, ponieważ sam wzór oświetlenia jest nadal ograniczony przez dyfrakcję.

SIM w domenie Fouriera. a) Akwizycja obrazu pojedynczej karty SIM. Transformata Fouriera zobrazowanej próbki jest spleciona z transformatą Fouriera jednowymiarowego gradientu sinusoidalnego. b) Wszystkie częstotliwości uzyskane po 4-krotnym obróceniu wzoru oświetlenia.

Koncepcje stojące za 2D SIM można rozszerzyć na obrazowanie wolumetryczne 3D. Wykorzystując trzy wzajemnie spójne wiązki światła wzbudzającego, w zobrazowanej próbce można utworzyć wzory interferencyjne z wieloma składowymi częstotliwości. Ostatecznie umożliwia to wykonywanie rekonstrukcji 3D z nawet dwukrotnie lepszą rozdzielczością we wszystkich trzech osiach. Jednak ze względu na silny współczynnik rozpraszania tkanek biologicznych, tę teoretyczną rozdzielczość można osiągnąć tylko w próbkach cieńszych niż około 10 μm. Poza tym rozpraszanie prowadzi do nadmiaru sygnału tła, co uniemożliwia dokładną rekonstrukcję.

Mikroskopia arkusza świetlnego

Typowa konfiguracja mikroskopii z lekkim arkuszem.

Mikroskopia arkuszy świetlnych (LSM) została opracowana w celu umożliwienia precyzyjnego cięcia optycznego grubych próbek biologicznych bez konieczności fizycznego cięcia lub oczyszczania, co jest zarówno czasochłonne, jak i szkodliwe dla obrazowania in vivo. Podczas gdy większość technik obrazowania fluorescencyjnego wykorzystuje wyrównane osie oświetlenia i wykrywania, LSM wykorzystuje osie ortogonalne. Skupiony arkusz światła służy do oświetlania próbki z boku, podczas gdy sygnał fluorescencyjny jest wykrywany z góry. Eliminuje to zarówno „problem stożka” mikroskopii szerokokątnej, eliminując wpływ nieostrości z płaszczyzn, które nie są aktywnie obrazowane, jak i zmniejsza wpływ fotowybielania, ponieważ cała próbka nie jest oświetlana podczas obrazowania. Ponadto, ponieważ próbka jest oświetlana z boku, skupienie światła oświetlającego nie jest zależne od głębokości, co znacznie ułatwia obrazowanie wolumetryczne próbek biologicznych. Głównym ciągłym wyzwaniem w LSM jest kształtowanie lekkiego arkusza. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kompromis między grubością warstwy światła na osi optycznej (co w dużej mierze determinuje rozdzielczość osiową) a polem widzenia, w którym warstwa światła zachowuje odpowiednią grubość. Ten problem można częściowo rozwiązać, dodając rozwiązanie SI-LSM.

Techniki

SI-LSM można podzielić na dwie główne kategorie. Sekcje optyczne SI-LSM to najpowszechniejsze podejście, które poprawia rozdzielczość osiową poprzez dalsze zmniejszenie wpływu nieostrego sygnału tła. SI-LSM o super rozdzielczości wykorzystuje techniki oświetlenia i rekonstrukcji 2D SIM w celu uzyskania super rozdzielczości w próbkach 3D.

Sekcje optyczne SI-LSM

Sekcja optyczna SI-LSM (OS-SI-LSM) została po raz pierwszy opisana w artykule z 1997 roku przez MA Neila i in. Zamiast osiągać superrozdzielczość, technika ta wykorzystuje idee leżące u podstaw oświetlenia strukturalnego w celu poprawy rozdzielczości osiowej poprzez usunięcie zamglenia tła z warstw innych niż obszary, w których oświetlający arkusz światła jest najbardziej skupiony. Chociaż istnieje kilka sposobów osiągnięcia tego celu, najbardziej powszechnym podejściem jest „trójfazowa” karta SIM, która zostanie opisana tutaj.

W artykule Neila pokazano, że sygnał uzyskany przez obrazowanie celu za pomocą wzoru oświetlenia siatki można przedstawić za pomocą następującego równania:

$\ Displaystyle I_ {n} = I_ {0} + I_ {c} \ cos (\ fi) + I_ {s} \ grzech (\ fi )}$

Tutaj ${\ displaystyle I_ {0}}$${s}}$ sygnał tła, podczas gdy { $I_$ to sygnały z obszaru celu oświetlonego przez cosinus i składowe sinusoidalne siatki. Pokazano również, że ostry obraz interesującej nas płaszczyzny można zrekonstruować za pomocą równania:

${\ Displaystyle I_ {p} = (I_ {c} ^ {2} + I_ {s} ^ {2}) ^ {0,5}}$

Można to osiągnąć przez pobranie trzech oddzielnych obrazów w warunkach oświetlenia siatki, obracając siatkę o 60° pomiędzy każdą akwizycją. Pożądany obraz 2D można następnie zrekonstruować za pomocą równania:

${\ Displaystyle I_ {p} = ((I_ {1} -I_ {2} })^{2}+(I_{1}-I_{3})^{2}+(I_{2}-I_{3})^{2})^{0,5}}$

Spowoduje to utworzenie obrazu 2D zawierającego tylko informacje z najbardziej skupionego obszaru wzoru oświetlenia siatki. Jeśli ten wzór jest tworzony przy użyciu lekkiego arkusza, arkusz można następnie zeskanować w kierunku osiowym, aby wygenerować pełną rekonstrukcję 3D próbki. Podstawową wadą stosowania tego podejścia do redukcji sygnału tła jest to, że ostatecznie polega ono na odjęciu wspólnego sygnału tła między dwoma obrazami. Część sygnału ostrości zostanie nieuchronnie odjęta wraz z zamgleniem tła. Spowoduje to ogólne zmniejszenie sygnału, co może być szkodliwe w przypadku obrazowania fluorescencyjnego o niskim sygnale. Niemniej jednak ta technika jest najczęstszym zastosowaniem SI-LSM i wykazała lepszą rozdzielczość osiową w porównaniu z samą LSM.

SI-LSM o super rozdzielczości

SI-LSM o super rozdzielczości (SR-SI-LSM) wykorzystuje techniki z 2D lub 3D SIM, używając arkusza światła jako źródła oświetlenia, aby osiągnąć przestrzenną rozdzielczość SIM wraz z obrazowaniem niezależnym od głębokości i niskim fotowybielaniem LSM. W najpowszechniejszym zastosowaniu arkusz świetlny jest używany do tworzenia sinusoidalnego wzoru 1D na pojedynczej płaszczyźnie docelowej próbki 3D. Wzór jest następnie wielokrotnie obracany w tej pojedynczej płaszczyźnie, aby uzyskać wystarczającą liczbę obrazów do rekonstrukcji 2D w wysokiej rozdzielczości. Światło jest skanowane w rozdzielczości osiowej, a proces jest powtarzany, aż do uzyskania wystarczającej liczby obrazów 2D do pełnej rekonstrukcji 3D. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to wykazuje nie tylko lepszą rozdzielczość, ale także lepszy SNR w porównaniu z OS-SI-LSM, ponieważ żadne informacje nie są odrzucane podczas rekonstrukcji. Ponadto, chociaż teoretyczna rozdzielczość dla SR-SI-LSM jest nieco niższa niż 3D SIM, na głębokościach > 10 um ta technika wykazuje lepszą wydajność niż 3D SIM ze względu na niezależne od głębokości ogniskowanie światła charakterystycznego dla LSM.

Realizacja

Głównym wyzwaniem w SI-LSM są systemy inżynieryjne, które są fizycznie zdolne do generowania ustrukturyzowanych wzorów w lekkich arkuszach. Trzy główne podejścia do osiągnięcia tego celu to użycie interferujących arkuszy świetlnych, cyfrowego LSM i przestrzennych modulatorów światła.

W przypadku interferujących arkuszy świetlnych do próbki wysyłane są dwa spójne arkusze przeciwbieżne. Wzór interferencji między tymi arkuszami tworzy pożądany wzór oświetlenia, który można obracać i skanować za pomocą obrotowych luster w celu odchylenia arkuszy. Dodatkową elastyczność można dodać, stosując cyfrową mikroskopię arkuszy świetlnych do generowania wzorów oświetlenia. W cyfrowym LSM arkusz światła jest tworzony przez szybkie skanowanie wiązki lasera przez próbkę. Pozwala to na precyzyjną kontrolę nad określonym wzorem oświetlenia poprzez modulację intensywności lasera podczas skanowania. Technika ta została wykorzystana do stworzenia systemów zdolnych do wielu typów mikroskopii arkuszy świetlnych oprócz SI-LSM. Wreszcie przestrzenne modulatory światła mogą być używane do elektronicznego sterowania wzorami świetlnymi, co ma tę zaletę, że pozwala na bardzo precyzyjną kontrolę i szybkie przełączanie między wzorami.

Ponadto wiele ostatnich prac wokół SI-LSM koncentruje się na połączeniu tego podejścia z innymi technikami głębokiego obrazowania tkanek biologicznych. Na przykład artykuł z 2021 roku wykazał zastosowanie SI-LSM z oświetleniem NIR-II w celu poprawy rozdzielczości przezczaszkowego obrazowania mózgu myszy o ~ 1,7x przy głębokości penetracji ~ 750 um i prawie 16-krotnej poprawie stosunku sygnału do tła. Inne obiecujące kierunki obejmują łączenie SIM z innymi technikami kształtowania arkuszy świetlnych w LSM, łączenie SI-LSM ze wzbudzeniem dwufotonowym lub wykorzystanie nieliniowej fluorescencji w celu dalszego przesuwania granic rozdzielczości.