Mikroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Mikroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego ( SPRM ), zwana także obrazowaniem powierzchniowego rezonansu plazmonowego ( SPRI ), jest narzędziem analitycznym bez etykiet, które łączy powierzchniowy rezonans plazmonowy powierzchni metalowych z obrazowaniem powierzchni metalicznej. Heterogeniczność współczynnika załamania światła powierzchni metalicznej nadaje obrazy o wysokim kontraście, spowodowane przesunięciem kąta rezonansu. SPRM może osiągnąć czułość grubości poniżej nanometra, a rozdzielczość boczna osiąga wartości w skali mikrometrycznej. SPRM służy do charakteryzowania powierzchni, takich jak samoorganizujące się monowarstwy , folie wielowarstwowe , nanocząstki metali , macierze oligonukleotydowe oraz reakcje wiązania i redukcji. Polarytony plazmonów powierzchniowych to powierzchniowe fale elektromagnetyczne sprzężone z oscylującymi swobodnymi elektronami powierzchni metalicznej, które rozchodzą się wzdłuż granicy faz metal/dielektryk. Ponieważ polarytony są bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany współczynnika załamania materiału metalicznego, można je wykorzystać jako narzędzie bioczujnikowe, które nie wymaga oznakowania. Pomiary SPRM można wykonywać w czasie rzeczywistym, na przykład mierzyć kinetykę wiązania białek błonowych w pojedynczych komórkach lub hybrydyzacji DNA.

Historia

Koncepcja klasycznego SPR istnieje od 1968 roku, ale technika obrazowania SPR została wprowadzona w 1988 roku przez Rothenhäuslera i Knolla. Uzyskanie obrazu o wysokiej rozdzielczości próbek o niskim kontraście dla optycznych technik pomiarowych było zadaniem prawie niemożliwym do czasu wprowadzenia techniki SPRM, która powstała w 1988 roku. W technice SPRM do oświetlenia wykorzystuje się plazmonowe powierzchniowe fale polarytonowe (PSP). Mówiąc prościej, technologia SPRI jest zaawansowaną wersją klasycznej analizy SPR, w której próbka jest monitorowana bez etykiety za pomocą kamery CCD. Technologia SPRI za pomocą kamery CCD umożliwia rejestrację sensogramów i obrazów SPR, jednocześnie analizując setki interakcji.

Zasady

Plazmony powierzchniowe lub polarytony plazmonów powierzchniowych są generowane przez sprzężenie pola elektrycznego z wolnymi elektronami w metalu. Fale SPR rozchodzą się wzdłuż granicy między dielektrykami a warstwą przewodzącą bogatą w wolne elektrony.

Jak pokazano na rysunku 2, gdy światło przechodzi z ośrodka o wysokim współczynniku załamania światła do drugiego ośrodka o niższym współczynniku załamania światła, w pewnych warunkach światło jest całkowicie odbijane.

Aby uzyskać całkowite wewnętrzne odbicie (TIR), θ ₁ i θ ₂ powinny mieścić się w pewnym zakresie, który można wyjaśnić prawem Snella. Kiedy światło przechodzi przez ośrodek o wysokim współczynniku załamania światła do ośrodka o niższym współczynniku załamania światła, odbija się pod kątem θ ₂ , który jest zdefiniowany w równaniu 1.

${\ Displaystyle \ teta _ {2} = \ grzech ^ {- 1} \ lewo ({\ Frac {\ eta _ {1}}} {\ eta _{2}}}\sin \theta_{1}\right)}$

 

 

 

 

(Równanie 1)

Rysunek 2. Całkowite wewnętrzne odbicie (TIR), wiązka światła padająca pod kątem θ ₁ , przechodzi przez ośrodek o współczynniku załamania η ₁ , wiązka odbija się z powrotem pod kątem θ ₂ , gdy współczynnik załamania ośrodka zmienia się na wartość η ₂ .

W procesie TIR pewna część odbitego światła przepuszcza niewielką część natężenia pola elektrycznego do ośrodka 2 ( η ₁ > η ₂ ). Światło przedostające się do ośrodka 2 przenika jako zanikająca fala. Intensywność i głębokość penetracji zanikającej fali można obliczyć odpowiednio z równań 2 i 3.

${\ Displaystyle I_ {z} = I_ {0} \ exp \ lewo ({\ Frac {-z} {d_ {p}}} \ prawej)}$

 

 

 

 

(Równanie 2)

${\ Displaystyle d_ {p} = {\ Frac {\ lambda} {4 \ pi {\ sqrt {\ eta _ {1} ^ {2 }\sin ^{2}\theta _{1}-\eta _{2}^{2}}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 3)

Rycina 3 przedstawia schematyczną reprezentację plazmonów powierzchniowych sprzężonych z oscylacjami gęstości elektronowej. Fala świetlna jest wychwytywana na powierzchni warstwy metalu poprzez kolektywne sprzężenie z elektronami powierzchni metalu. Kiedy plazma elektronu i pole elektryczne fali świetlnej łączą swoje oscylacje częstotliwości, wchodzą w rezonans.

Rysunek 3. Karykatura przedstawiająca propagację polarytonów wzdłuż interfejsu metalowego dielektryka, bogate i ubogie obszary gęstości elektronowej są określane odpowiednio jako + i –.

Ostatnio sfotografowano wyciek światła wewnątrz metalowej powierzchni. Promieniowanie o różnych długościach fal (zielonej, czerwonej i niebieskiej) zostało przekształcone w powierzchniowe polarytony plazmonowe poprzez oddziaływanie fotonów na granicy faz metal/dielektryk. Zastosowano dwie różne powierzchnie metalowe; złoto i srebro. Porównano długość propagacji SPP wzdłuż płaszczyzny xy (płaszczyzny metalu) dla każdej długości fali metalu i fotonu. Długość propagacji jest zdefiniowana jako odległość przebyta przez SPP wzdłuż metalu, zanim jego intensywność spadnie o współczynnik 1/e, jak określono w Równaniu 4.

Rysunek 4 przedstawia światło wycieku zarejestrowane przez kolorową kamerę CCD, fotonów zielonego, czerwonego i niebieskiego w filmach złotych (a) i srebrnych (b). W części c) rysunku 4 pokazano intensywność polarytonów plazmonów powierzchniowych wraz z odległością. Ustalono, że natężenie światła rozproszenia jest proporcjonalne do natężenia w falowodzie.

${\ Displaystyle \ delta _ {\ tekst {SPP}} \ około \ lambda _ {0} \ lewo \ {{\ Frac {(\ varepsilon _ {n}')^{2}}{2\pi \varepsilon _{m}''}}\right\}}$

 

 

 

 

(Równanie 4)

gdzie δ _SPP jest długością propagacji; ε'm i ε''m to względna przenikalność metalu, a λ0 to długość fali w wolnej przestrzeni.

Folia metaliczna jest zdolna do pochłaniania światła dzięki spójnej oscylacji elektronów pasma przewodnictwa indukowanej przez oddziaływanie z polem elektromagnetycznym. Elektrony w paśmie przewodnictwa indukują polaryzację po oddziaływaniu z polem elektrycznym promieniowania. Na powierzchni metalowej warstwy powstaje różnica ładunków netto, tworząc kolektywną dipolarną oscylację elektronów o tej samej fazie. Kiedy ruch elektronu odpowiada częstotliwości pola elektromagnetycznego, następuje absorpcja padającego promieniowania. Częstotliwość oscylacji plazmonów powierzchniowych złota znajduje się w widzialnym obszarze widma elektromagnetycznego, dając kolor czerwony, podczas gdy srebro daje kolor żółty. Nanopręciki wykazują dwa piki absorpcji w obszarze UV-vis z powodu oscylacji wzdłużnej i poprzecznej, w przypadku nanoprętów złotych oscylacja poprzeczna generuje pik przy 520 nm, podczas gdy oscylacja podłużna generuje absorpcję przy dłuższych długościach fal, w zakresie od 600 do 800 nm. Nanocząsteczki srebra przesuwają długości fal absorpcji światła na wyższe poziomy energii, gdzie przesunięcie niebieskiego przechodzi od 408 nm do 380 nm i 372 nm, gdy zmieniają się odpowiednio z kuli na pręt i drut. Intensywność absorpcji i długość fali złota i srebra zależy od wielkości i kształtu cząstek.

Na rycinie 5 rozmiar i kształt nanocząstek srebra wpłynęły na intensywność rozproszonego światła i maksymalną długość fali nanocząstek srebra. Trójkątne cząstki są czerwone z maksymalnym rozproszeniem światła przy 670-680 nm, pięciokątne cząstki pojawiają się na zielono (620-630 nm), a sferyczne cząstki mają wyższe energie absorpcji (440-450 nm), pojawiają się na niebiesko.

Metody wzbudzania plazmonów

Powierzchniowe polarytony plazmonowe są kwazicząstkami złożonymi z fal elektromagnetycznych sprzężonych z wolnymi elektronami pasma przewodnictwa metali. Jedną z szeroko stosowanych metod sprzęgania światła spolaryzowanego p z interfejsem metal-dielektryk jest sprzężenie oparte na pryzmacie. Sprzęgacze pryzmowe są najczęściej stosowane do wzbudzania polarytonów plazmonów powierzchniowych. Ta metoda jest również nazywana konfiguracją Kretschmanna-Raethera, w której TIR tworzy zanikającą falę, która łączy wolne elektrony z powierzchni metalu. Soczewki obiektywowe o dużej aperturze numerycznej zostały zbadane jako wariant sprzężenia pryzmatycznego w celu wzbudzenia powierzchniowych polarytonów plazmonowych. Sprzężenie falowodowe jest również wykorzystywane do tworzenia plazmonów powierzchniowych.

Sprzężenie pryzmatyczne

Konfiguracja Kretschmanna-Raethera służy do uzyskania rezonansu między światłem a swobodnymi elektronami powierzchni metalu. W tej konfiguracji pryzmat o wysokim współczynniku załamania światła jest połączony z warstwą metalu. Światło ze źródła rozchodzi się przez pryzmat i pada na metalową warstwę. W wyniku TIR niektóre wyciekły przez warstwę metalu, tworząc falę zanikającą w ośrodku dielektrycznym, jak na rysunku 6. Fala zanikająca przenika na charakterystyczną odległość do ośrodka mniej optycznie gęstego, gdzie ulega osłabieniu.

Rysunek 6 przedstawia konfigurację Kretschmanna-Raethera, w której pryzmat o współczynniku załamania światła η ₁ jest sprzężony z powierzchnią dielektryczną o współczynniku załamania światła η ₂ , a kąt padania światła wynosi θ .

Interakcję między światłem a polarytonami powierzchniowymi w TIR można wyjaśnić za pomocą wielowarstwowego odbicia Fresnela; współczynnik odbicia amplitudy ( rpmd ) jest wyrażony w równaniu 5 w następujący sposób _.

$\ Displaystyle r_ {pmd} = {\ Frac {r_ {pm} +r_{md}e^{2ik_{m\razy q}}}{1+r_{pm}r_{md}e^{2ik_{m\razy q}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 5)

Współczynnik odbicia mocy R jest zdefiniowany w następujący sposób:

${\ Displaystyle R = \| r_ {pmd} \|^ {2}}$

 

 

 

 

(Równanie 6)

Na rycinie 7 pokazano schematyczną reprezentację pryzmatu sprzęgającego pryzmat Otto. Na rysunku 7 szczelina powietrzna została pokazana jako nieco gruba, aby wyjaśnić schemat, chociaż w rzeczywistości szczelina powietrzna jest bardzo cienka między pryzmatem a warstwą metalu.

Sprzężenie falowodowe

Fale elektromagnetyczne są przewodzone przez falowód optyczny. Kiedy światło dociera do obszaru z cienką warstwą metalu, przenika przez warstwę metalu, wzbudzając powierzchniową falę plazmonową (SPW). W konfiguracji ze sprzężeniem falowodu falowód jest tworzony, gdy współczynnik załamania siatki jest większy niż współczynnik załamania podłoża. Promieniowanie padające rozchodzi się wzdłuż warstwy falowodu z wysokim współczynnikiem załamania. Na rysunku 8 fale elektromagnetyczne są prowadzone przez warstwę przewodzącą fale, a gdy fale optyczne osiągną metalową warstwę przewodzącą fale międzyfazowe, powstaje fala zanikająca. Zanikająca fala wzbudza plazmon powierzchniowy na granicy faz metal-dielektryk.

Sprzęgło kratowe

Ze względu na siatkę okresową dopasowanie fazowe między światłem padającym a trybem przewodnim jest łatwe do uzyskania. Zgodnie z równaniem 7 wektor propagacji ( Kz ) w kierunku z można dostroić zmieniając okresowość Λ. Wektor siatki można modyfikować, a kąt wzbudzenia rezonansowego można kontrolować. Na rysunku 9 q oznacza rząd dyfrakcji, w którym może przyjmować wartości dowolnej liczby całkowitej (dodatniej, ujemnej lub zerowej).

${\ Displaystyle K_ {z} = q \ {2 \ pi / \ Lambda \}}$

 

 

 

 

(Równanie 7)

Metody pomiaru rezonansu

Stała propagacji monochromatycznej wiązki światła równoległej do powierzchni jest określona równaniem 8.

${\ Displaystyle k_ {x} = {\ Frac {2 \ pi} {\ lambda}} n_ {p} \ sin \ teta}$

 

 

 

 

(Równanie 8)

gdzie θ to kąt padania, k _sp to stała propagacji plazmonu powierzchniowego, a n _{( p )} to współczynnik załamania pryzmatu. Kiedy wektor falowy SPW, k _sp pasuje do wektora falowego padającego światła $SPW$ wyraża się jako

${\ Displaystyle k_ {sp} = {\ Frac {2 \ pi} {\ lambda}}} {\ sqrt {\ Frac {\ varepsilon _ {m }+\varepsilon _{d}}{\varepsilon _{m}+\varepsilon _{d}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 9)

Tutaj εd i εm reprezentują stałą dielektryczną dielektryków i metalu, podczas gdy długość fali padającego światła odpowiada λ . kx i ksp można przedstawić jako:

${\ Displaystyle \ teta _ {sp} = \ sin ^ {- 1} {\ sqrt {\ Frac {\ varepsilon _ {m }\varepsilon _{d}}{\varepsilon _{p}(\varepsilon _{m}+\varepsilon _{d})}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 10)

Plazmony powierzchniowe to zanikające fale, które mają maksymalne natężenie na granicy faz i zanikają wykładniczo od granicy faz do głębokości penetracji. Na propagację plazmonów powierzchniowych duży wpływ ma cienka powłoka na warstwie przewodzącej. Kąt rezonansu θ przesuwa się, gdy powierzchnia metalu jest pokryta materiałem dielektrycznym, w wyniku zmiany wektora propagacji k plazmonu powierzchniowego. Ta czułość wynika z płytkiej głębokości penetracji zanikającej fali. Stosowane są materiały z dużą ilością wolnych elektronów. Stosowane są folie metalowe o grubości około 50 nm wykonane z miedzi, tytanu, chromu i złota. Jednak Au jest najczęściej stosowanym metalem w SPR, jak również w SPRM.

Kąt skanowania SPR jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy procent współczynnika odbicia (%R) z zespołu pryzmat/metalowa folia w funkcji kąta padania przy ustalonej długości fali wzbudzenia. Gdy kąt padania odpowiada stałej propagacji interfejsu, mod ten jest wzbudzany kosztem światła odbitego. W konsekwencji wartość współczynnika odbicia przy kącie rezonansu zostaje zrzucona.

Stałą propagacji polarytonów można modyfikować, zmieniając materiał dielektryczny. Ta modyfikacja powoduje przesunięcie kąta rezonansu, jak w przykładzie pokazanym na rysunku 10, od θ ₁ do θ ₂ w wyniku zmiany powierzchniowej stałej propagacji plazmonu.

Kąt rezonansu można znaleźć za pomocą równania 11.

${\ Displaystyle \ teta _ {\ tekst {SPR}} = \ sin ^ {- 1} \ lewo ({{ \frac {1}{n_{1}}}{\sqrt {\frac {n_{2}^{2}n_{g}^{2}}{n_{2}^{2}+n_{g} ^{2}}}}\,\prawo)}$

 

 

 

 

(Równanie 11)

gdzie n ₁ to n ₂ , a n _g to współczynniki załamania odpowiednio ośrodka 1, 2 i warstwy metalicznej.

Wykorzystując obrazowanie dwuwymiarowe TIR możliwe jest uzyskanie różnic przestrzennych w %R przy stałym kącie θ . Wiązka światła monochromatycznego jest używana do naświetlania próbki pod stałym kątem padania. Obraz SPR jest tworzony z odbitego światła wykrytego przez kamerę CCD. Minimalna wartość %R przy kącie rezonansu zapewnia SPRM.

Huang i współpracownicy opracowali mikroskop z obiektywem o dużej aperturze numerycznej (NA), który poprawia rozdzielczość boczną kosztem rozdzielczości podłużnej.

Rozdzielczość boczna

Rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest ograniczona granicą dyfrakcji światła. W SPRM wzbudzone plazmony powierzchniowe przyjmują konfigurację poziomą z padającej wiązki światła. Polarytony będą przemieszczać się wzdłuż granicy faz metal-dielektryk przez określony czas, aż rozpadną się z powrotem na fotony. Dlatego rozdzielczość osiągnięta przez SPRM jest określona przez długość propagacji ksp plazmonów powierzchniowych równoległych do płaszczyzny padającej. Separacja między dwoma obszarami powinna być w przybliżeniu równa wielkości ksp, aby została rozwiązana. Berger, Kooyman i Greve wykazali, że rozdzielczość poprzeczną można dostroić, zmieniając długość fali wzbudzenia, im lepszą rozdzielczość uzyskuje się, gdy energia wzbudzenia wzrasta. Równania 4 i 12 definiują wielkość wektora falowego plazmonów powierzchniowych.

${\ Displaystyle k_ {sp} = {\ Frac {2 \ pi} {\ lambda}}} {\ sqrt {\ Frac {n_ { 2}^{2}n_{g}^{2}}{n_{b}^{2}+b_{g}^{2}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 12)

gdzie n ₂ jest współczynnikiem załamania światła ośrodka 2, n _g jest współczynnikiem załamania powłoki metalowej, a λ jest długością fali wzbudzenia.

Oprzyrządowanie

Mikroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego opiera się na powierzchniowym rezonansie plazmonowym i rejestrowaniu pożądanych obrazów struktur obecnych na podłożu za pomocą instrumentu wyposażonego w kamerę CCD. W ostatniej dekadzie wykazano, że wykrywanie SPR jest niezwykle potężną techniką i jest szeroko stosowane w badaniach i rozwoju materiałów, biochemii i naukach farmaceutycznych.

Instrument SPRM działa z kombinacją następujących głównych komponentów: źródło światła (zwykle laser He-Ne), które przechodzi dalej przez pryzmat przymocowany do szklanej strony pokrytej cienką warstwą metalu (zwykle złota lub srebra), gdzie wiązka światła odbija się od granicy faz złoto/roztwór pod kątem większym niż kąt krytyczny. Światło odbite od powierzchni interfejsu jest rejestrowane przez detektor CCD i zapisywany jest obraz. Chociaż wyżej wymienione komponenty są ważne dla SPRM, dodatkowe akcesoria, takie jak polaryzatory, filtry, ekspandery wiązki, soczewki skupiające, stolik obrotowy itp., podobnie jak kilka metod obrazowania, są instalowane i używane w oprzyrządowaniu w celu uzyskania skutecznej techniki mikroskopowej, jak np. wymagane przez aplikację. Rysunek 12 przedstawia typowy SPRM. W zależności od zastosowań oraz w celu optymalizacji techniki obrazowania, naukowcy modyfikują to podstawowe oprzyrządowanie, wprowadzając pewne zmiany konstrukcyjne, które obejmują nawet zmianę wiązki źródłowej. Jedną z takich zmian konstrukcyjnych, która doprowadziła do innego SPRM, jest typ obiektywu, jak pokazano na rysunku 11, z pewną modyfikacją konfiguracji optycznej.

Systemy SPRi są obecnie produkowane przez znanych producentów oprzyrządowania biomedycznego, takich jak GE Life Sciences, HORIBA, Biosensing USA itp. Koszt rangera SPRi waha się od 100 do 250 tys. USD, choć proste prototypy demonstracyjne można wykonać już za 2000 USD.

przygotowanie próbki

Aby wykonać pomiary dla SPRM, przygotowanie próbki jest krytycznym krokiem. Etap unieruchamiania może mieć wpływ na dwa czynniki: jednym z nich jest niezawodność i odtwarzalność uzyskanych danych. Ważne jest zapewnienie stabilności elementu rozpoznawania; takie jak przeciwciała, białka, enzymy, w warunkach eksperymentu. Ponadto stabilność unieruchomionych próbek wpłynie na czułość i/lub granicę wykrywalności (LOD).

Jedną z najpopularniejszych metod immobilizacji jest Self-Assembled Monolayer (SAM) na złotej powierzchni. Jenkins i współpracownicy 2001 użyli plastrów merkaptoetanolu otoczonych SAM składającym się z oktadekanotiolu (ODT) do zbadania adsorpcji fosfatydylocholiny jaja na ODT SAM. Wzór ODT-merkaptoetanolu wykonano na złotej warstwie 50 nm. Złotą warstwę otrzymano przez odparowanie termiczne na szkle LaSFN 9. Pęcherzyki lipidowe osadzały się na ODT SAM poprzez adsorpcję, dając końcową grubość wielu warstw większą niż 80 Å.

Samozmontowana monowarstwa kwasu 11-merkaptoundekanowego (MUA-SAM) została utworzona na szkiełkach BK7 pokrytych złotem. Płytkę PDMS zamaskowano na chipie MUA-SAM. Clenbuterol (CLEN) został przyłączony do cząsteczek BSA poprzez wiązanie amidowe pomiędzy grupą karboksylową BSA a grupą aminową cząsteczek CLEN. W celu unieruchomienia BSA na powierzchni złota, plamy powstałe w wyniku wytwarzania PDMS funkcjonalizowano sulfo-NHS i EDC, następnie w plamy wlano 1% roztwór BSA i inkubowano przez 1 godzinę. Nieunieruchomiony BSA wypłukano PBS i plamy wylano roztworem CLEN, nieunieruchomiony CLEN usunięto przez przepłukanie PBS.

Przygotowano alkanotiol-SAM w celu jednoczesnego pomiaru stężenia peroksydazy chrzanowej (Px), ludzkiej immunoglobuliny E (IgE), ludzkiej choriogonadotropiny (hCG) i ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) poprzez SPR. Alkanotiole zbudowane z łańcuchów węglowych składających się z 11 i 16 atomów węgla były samoorganizujące się na chipie czujnika. Przeciwciała były przyłączone do alkanotiolu C16, który miał końcową grupę karboksylową.

Elektrodę z mikrowzorem wytworzono przez osadzanie złota na szkiełkach mikroskopowych. Stemplowanie PDMS zastosowano do wytworzenia szeregu powierzchni hydrofilowych/hydrofobowych; Traktowanie ODT, a następnie zanurzenie w roztworach 2-merkaptoetanolu, dało funkcjonalizowaną powierzchnię do osadzania błon lipidowych. Wzorzysta elektroda została scharakteryzowana za pomocą SPRM. Na rycinie 14 B obraz SPRM pokazuje rozmiar kieszeni, który wynosił 100 µm x 100 µm i były one oddalone od siebie o 200 µm. Jak widać na obrazie, niezwykły kontrast obrazu wynika z wysokiej czułości techniki.

Aplikacje

SPRM jest przydatną techniką do pomiaru stężenia biomolekuł w roztworze, wykrywania cząsteczek wiążących i monitorowania interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym. Może być stosowany jako bioczujnik do powierzchniowych oddziaływań cząsteczek biologicznych: wiązania antygen-przeciwciało, mapowania i kinetyki sorpcji. Na przykład jedną z możliwych przyczyn cukrzycy typu 1 u dzieci jest wysoki poziom przeciwciał IgG, IgA, IgM (głównie z powodu IgA) mleka krowiego w ich surowicy. Przeciwciała mleka krowiego można wykryć w próbce mleka i surowicy za pomocą SPRM. SPRM jest również korzystny do wykrywania specyficznego miejsca przyczepu limfocytów B lub T do macierzy przeciwciał. Ta technika jest wygodna do badania interakcji komórek na powierzchni bez znaczników iw czasie rzeczywistym. Tak więc SPRM może służyć jako narzędzie diagnostyczne do kinetyki adhezji powierzchniowej komórki. Poza zaletami SPRM ma jednak swoje ograniczenia. Nie ma zastosowania do wykrywania cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Chociaż jest wolny od etykiet, ale będzie musiał mieć krystalicznie czyste warunki eksperymentalne. Czułość SPRM można poprawić poprzez sprzężenie MALDI-MS. Istnieje wiele zastosowań SPRM, z których niektóre są opisane tutaj.

Białka błonowe

Białka błonowe są odpowiedzialne za regulację odpowiedzi komórkowych na sygnały zewnątrzkomórkowe. Wyzwaniem było zbadanie udziału białek błonowych w biomarkerach chorób i celach terapeutycznych oraz ich kinetyki wiązania z ich ligandami. Tradycyjne podejścia nie mogły odzwierciedlać jasnych struktur i funkcji białek błonowych. Aby zrozumieć szczegóły strukturalne białek błonowych, potrzebne jest alternatywne narzędzie analityczne, które może zapewnić trójwymiarowe i sekwencyjne rozdzielczości, które mogą monitorować białka błonowe. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest doskonałą metodą uzyskiwania obrazów białek błonowych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale badanie kinetyki jej wiązania może nie być pomocne. Mikroskopia fluorescencyjna (FLM) może być wykorzystana do badania interakcji białek błonowych w poszczególnych komórkach, ale wymaga opracowania odpowiednich etykiet i taktyk dla różnych białek docelowych. Ponadto znakowanie może wpływać na białko gospodarza.

Kinetykę wiązania MP w pojedynczych żywych komórkach można badać za pomocą metody obrazowania bez znaczników opartej na mikroskopii SPR bez ekstrakcji białek z błon komórkowych, co pomaga naukowcom pracować z rzeczywistymi konformacjami białek błonowych. Ponadto można mapować i obliczać dystrybucję i lokalne aktywności wiązania białek błonowych w każdej komórce. Mikroskopia SPR (SPRM) umożliwia jednoczesne obrazowanie optyczne i fluorescencyjne tej samej próbki, co zapewnia zalety metod detekcji opartej na znacznikach i bez znaczników w jednym ustawieniu.

Wykrywanie hybrydyzacji DNA

Obrazowanie SPR służy do badania wielu interakcji adsorpcyjnych w formacie macierzy w tych samych warunkach eksperymentalnych. Nelson i jego współpracownicy wprowadzili wieloetapową procedurę tworzenia macierzy DNA na złotych powierzchniach do wykorzystania w obrazowaniu SPR. Interakcje powinowactwa można badać dla różnych cząsteczek docelowych, np. białek i kwasów nukleinowych. Niedopasowanie zasad w sekwencji DNA prowadzi do wielu śmiertelnych chorób, takich jak zespół linczu, który wiąże się z wysokim ryzykiem raka okrężnicy.

Obrazowanie SPR jest przydatne do monitorowania adsorpcji cząsteczek na powierzchni złota, co jest możliwe ze względu na zmianę współczynnika odbicia od powierzchni. Pierwsza para niedopasowanych zasad GG jest stabilizowana przez przyłączenie jej do ligandu, dimeru naftyrydyny, poprzez wiązania wodorowe, które tworzą struktury szpilki do włosów w dwuniciowym DNA na powierzchni złota. Wiązanie Dimeru z DNA zwiększa energię swobodną hybrydyzacji, co powoduje zmianę współczynnika załamania światła.

Rysunek 15. Struktura niedopasowania G – G stabilizującego dimer naftyrydyny (niebieski) jest pokazana jako wiązanie wodorowe z dwiema zasadami guaniny (czarny).

Macierz DNA jest wytwarzana w celu przetestowania właściwości stabilizujących niedopasowanie G – G dimeru naftyrydyny. Każda z czterech unieruchomionych sekwencji w macierzy różniła się o jedną zasadę. Pozycja tej zasady jest wskazana przez X w sekwencji 1, jak pokazano na fig. 16. Obraz różnicy SPR jest wykrywany tylko dla sekwencji zawierającej zasadę cytozyny (C) w pozycji X w sekwencji 1, sekwencji komplementarnej do sekwencji 2. Jednak obraz różnicy SPR odpowiadający dodaniu sekwencji 2 w obecności dimeru naftyrydyny pokazuje, że oprócz jej dopełnienia, sekwencja 2 również hybrydyzuje z sekwencją, która tworzy niedopasowanie G – G. Wyniki te pokazują, że obrazowanie SPR jest obiecującym narzędziem do monitorowania niedopasowań pojedynczych zasad i wykrywania zhybrydyzowanych cząsteczek.

Wiązanie przeciwciała z macierzami białkowymi

Obrazowanie SPR można wykorzystać do badania wiązania przeciwciał z macierzą białkową. Funkcjonalności aminowe na powierzchni złota z macierzą białek służą do badania wiązania przeciwciał. Immobilizację białka przeprowadzono przez przepuszczenie roztworów białek przez mikrokanały PDMS. Następnie PDMS usunięto z powierzchni i przez macierz przelano roztwory przeciwciał. Trójskładnikowa macierz białkowa zawierająca białka ludzki fibrynogen, albuminę jaja kurzego i bydlęcą IgG pokazano na rycinie 17, obrazy SPR uzyskane przez Kariuki i współpracowników. Ten kontrast w macierzy wynika z różnicy współczynnika załamania światła, która jest wynikiem lokalnego wiązania przeciwciał. Te obrazy pokazują, że istnieje wysoki stopień specyficzności wiązania przeciwciała i mały stopień niespecyficznej adsorpcji przeciwciała na tle macierzy, co można poprawić, modyfikując tło macierzy. Na podstawie tych wyników technikę obrazowania SPR można wybrać jako narzędzie diagnostyczne do badania interakcji przeciwciał z macierzami białkowymi.

W połączeniu ze spektrometrią mas

Odkrycie i walidacja biomarkerów białkowych ma kluczowe znaczenie dla diagnozowania chorób. Sprzężenie SPRM ze spektrometrem masowym MALDI (SUPRA-MS) umożliwia multipleksową ocenę ilościową wiązania i charakterystykę molekularną na podstawie różnych mas. SUPRA-MS służy do wykrywania, identyfikacji i charakteryzowania potencjalnego biomarkera raka piersi, białka LAG3, wprowadzanego do ludzkiego osocza. Pobrano szkiełka do przygotowania płatków złota poprzez powlekanie cienkimi warstwami chromu i złota w procesie napylania katodowego. Powierzchnię złota funkcjonalizowano roztworem 11-merkapto-1-undekanolu (11-MUOH) i kwasu 16-merkapto-1-heksadekanowego (16-MHA). Ta samoorganizująca się monowarstwa została aktywowana sulfo-NHS i EDC. Wzór szesnastu kropel został osadzony na makromacierzy. Przeciwciała immunoglobiny G wykrywano przeciwko genowi aktywacji limfocytów 3 (α-LAG3) i albuminie surowicy szczura (α-RSA). Po umieszczeniu biochipu w SPRi i przepuszczeniu roztworu buforowego do komory przepływowej wstrzyknięto α-LAG3. Na przyczepionych białkach zastosowano specjalną stację obrazowania. Ta stacja może być również umieszczona na MALDI. Przed umieszczeniem na MALDI, wychwycone białka zostały zredukowane, strawione i załadowane matrycą w celu uniknięcia zanieczyszczenia.

Gęstość antygenu jest wprost proporcjonalna do zmiany współczynnika odbicia ΔR, ponieważ głębokość penetracji zanikającej fali Lzc jest większa niż grubość unieruchomionej warstwy antygenu.

Gęstość antygenu ${\ Displaystyle {} = \ Gamma {\ Frac {pg} {mm ^ {2}}} = {\ Frac {\Delta R\times L_{zc}}{S_{PR}\times {\frac {\częściowy n}{\częściowy c}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 13)

gdzie $odbicia$ indeksu cząsteczki i $,$

Czyste widmo masowe otrzymano dla białka LAG3 dzięki dobremu trawieniu trypsyną i jednorodności matrycy (kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego). Stosunkowo wysoki pik m/z białka LAG3 stwierdzono przy 1422,70 amu ze średnią oceną maskotki 87,9 ± 2,4. Walidacja wyników MS została dodatkowo potwierdzona przez analizę MS-MS. Wyniki te są podobne do klasycznych metod analitycznych trawienia w żelu.

Większy S / N > 10, 100% niezawodność i wykrywanie na poziomie femtomola na chipie dowodzi wiarygodności tej techniki łączenia. Można znaleźć interakcję białko-białko i rozkład peptydów na chipie z wysoką rozdzielczością przestrzenną przy użyciu poddanej techniki.

Aptamery DNA

Aptamery to szczególne ligandy DNA, których celem są biomolekuły, takie jak białka. Platforma obrazowania SPR byłaby dobrym wyborem do scharakteryzowania interakcji aptamer-białko. Aby zbadać interakcję aptamer-białko, pierwsze oligonukleotydy są szczepione poprzez tworzenie tiolowej samoorganizującej się monowarstwy (SAM) na złotym podłożu przy użyciu piezoelektrycznego systemu dozującego. Grupy tiolowe są wprowadzane do nukleotydów DNA przez N-hydroksysukcynoimid (NHS). Docelowe oligonukleotydy mające pierwszorzędową grupę aminową na swoim 59-tym końcu sprzęga się z HS-C(11)-NHS w roztworze buforu fosforanowego przy pH 8,0 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Biosensor do szczepienia aptamerem jest umieszczany na SPRM po przepłukaniu. Następnie trombinę wstrzykuje się razem z nadmiarem cytochromu C w celu uzyskania specyficzności sygnału. Stężenie wolnej trombiny określa się za pomocą krzywej kalibracyjnej otrzymanej przez wykreślenie początkowego nachylenia sygnału na początku wstrzyknięcia w funkcji stężenia. Interakcję trombiny i aptameru można monitorować na mikromacierzy w czasie rzeczywistym podczas wstrzykiwania trombiny w różnych stężeniach. Stałą dysocjacji w fazie roztworu KDsol (3,16 ± 1,16 nM) oblicza się ze zmierzonych stężeń wolnej trombiny.

${\ Displaystyle K_ {D} ^ {\ tekst {sol}} = {\ Frac {[{\ tekst {THR}} [{\ tekst {APT}} ]}{{\text{THR}}\cdots {\text{APT}}}}}$

 

 

 

 

(Równanie 14)

[THR---APT] = cTHR – [THR], równowagowe stężenie trombiny przyłączonej do aptamerów w roztworze oraz [APT] = cAPT – [THR---APT], stężenie wolnych aptamerów w roztworze.

Stałą dysocjacji fazy powierzchniowej KDsurf (3,84 ± 0,68) uzyskuje się przez dopasowanie izotermy adsorpcji Langmuira do sygnałów równowagi. Obie stałe dysocjacji są znacznie różne, ponieważ KDsurf jest zależny od gęstości przeszczepu powierzchniowego, jak pokazano na rycinie 19. Ta zależność ekstrapoluje liniowo przy niskim sigma do powinowactwa fazy roztworu.

Różnica w obrazie SPRi może dostarczyć nam informacji dotyczących obecności wiązania i specyficzności, ale nie nadaje się do ilościowego oznaczania wolnego białka w przypadku wielu miejsc powinowactwa. Monitorowanie interakcji w czasie rzeczywistym jest możliwe dzięki wykorzystaniu SPRM do badania kinetyki i powinowactwa interakcji.

Wykrywanie interakcji polimerów

Pomimo wykorzystania powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPRi) w biologii do charakteryzowania interakcji między dwiema cząsteczkami biologicznymi, przydatne jest również monitorowanie interakcji między dwoma polimerami. W tym podejściu jeden polimer, zwany białkiem gospodarza HP, jest immobilizowany na powierzchni biochipa, a drugi polimer, oznaczony jako polimer gościnny GP, jest umieszczany na SPRi-Biochip w celu zbadania interakcji. Na przykład białko gospodarza poli(β-cyklodekstryny) funkcjonalizowanej aminą i białko gościa PEG (ada)4.

Biochip SPRi został użyty do immobilizacji HP o różnych stężeniach. Na chipie wyprodukowano szereg aktywnych miejsc HP. Przyłączenie HP nastąpiło poprzez jego grupy aminowe do grup funkcyjnych N-hydroksysukcynoimidowych na powierzchni złota. Pierwszy system SPRi został napełniony roztworem buforu roboczego, a następnie umieszczony w komorze analitycznej SPRi-biochip. Do celi przepływowej wstrzyknięto dwa roztwory GP o różnych stężeniach 1 g/l i 0,1 g/l. Asocjację i dysocjację obu polimerów można monitorować w czasie rzeczywistym na podstawie zmiany współczynnika odbicia, a obrazy z SPRM można rozróżnić na podstawie białych plam (faza asocjacji) i czarnych plam (faza dysocjacji). PEG bez grup adamantylowych nie wykazywał adsorpcji na zagłębieniach β-cyklodekstryny. Z drugiej strony nie było żadnej adsorpcji GP bez HP na chipie. Zmianę odpowiedzi SPRi w miejscach reakcji zapewnia przechwytywanie krzywych kinetycznych i obrazów w czasie rzeczywistym z kamery CCD. Lokalne zmiany współczynnika odbicia światła są bezpośrednio związane z ilością cząsteczek docelowych w każdym punkcie. Zmienność na powierzchni chipa zapewnia wszechstronną wiedzę na temat procesów wiązania molekularnego i kinetyki.

Biomineralizacja

Jedną z ważnych klas biomateriałów jest hydroksyapatyt polimerowy, który jest niezwykle przydatny w dziedzinie regeneracji kości ze względu na swoje podobieństwo do naturalnego materiału kostnego. Zaletą hydroksyapatytu (Ca10(PO4)6(OH)2 jest to, że zaczyna tworzyć się wewnątrz tkanki kostnej poprzez mineralizację, która również sprzyja wzmocnieniu osteointegracji. Biomineralizacja jest również nazywana zwapnieniem, w którym kationy wapnia pochodzą z komórek i fizjologicznych płyny, podczas gdy aniony fosforanowe powstają w wyniku hydrolizy fosfoestrów i fosfoprotein oraz z płynów ustrojowych.Zjawisko to jest również testowane w badaniach in vitro.

W badaniach in vitro dendrymery poliamidoaminowe (PAMAM) z zewnętrznymi powłokami reaktywnymi z aminokwasów i kwasów karboksylowych są uważane za fazę wykrywania. Te dendrymery muszą być unieruchomione na powierzchni złota i nieaktywne wobec powierzchni złota. Dlatego grupy tiolowe muszą być wprowadzone na końcach dendrymerów, aby dendrymery mogły być przyłączone do powierzchni złota. Grupy karboksylowe są funkcjonalizowane roztworami chlorowodorku N,N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu (EDC) i N-hydroksysukcynoimidu (NHS) w buforze fosforanowym. Grupy funkcyjne (amidowe, aminowe i karboksylowe) działają jak pompy jonowe wychwytujące jony wapnia z płynów testowych; następnie kationy wapnia wiążą się z anionami fosforanowymi, tworząc jądra minerałów wapniowo-fosforanowych na powierzchni dendrymeru.

Oczekuje się, że SPRM będzie wystarczająco czuły, aby dostarczyć ważnych informacji ilościowych na temat występowania i kinetyki mineralizacji. To wykrywanie mineralizacji opiera się na określonej zmianie masy wywołanej tworzeniem się i wzrostem zarodków mineralnych. Zarodkowanie i postęp mineralizacji można monitorować za pomocą SPRM, jak pokazano na rycinie 20. Czujniki zawierające PAMAM są mocowane na platformie analitycznej SPRi, a następnie wystawiane na działanie płynów doświadczalnych w celi przepływowej, jak pokazano na rycinie 21. SPRM nie jest przystosowany do wykrywania pochodzenia i charakteru zmiany masy, ale wykrywa modyfikację współczynnika załamania światła spowodowaną wytrącaniem się minerałów.