Mikroskopia z odbiciem interferencyjnym

Zasada interferencyjnej mikroskopii odbiciowej (IRM) pokazująca wpływ interferencji na fale odbite i wynik na intensywność końcowego obrazu. Ciemnofioletowa fala reprezentuje światło ze źródła światła. Jasnofioletowe fale to odbicia od błony komórkowej i od powierzchni szkła. Po uderzeniu w powierzchnię szkła odbite fale są przesuwane o połowę długości fali. Gdy membrana znajduje się bardzo blisko szkła, odbite światło będzie odbijane w fazie z wiązką odbitą od szkła. Spowoduje to destrukcyjną interferencję (patrz czerwona linia), skutkującą ciemnym pikselem. Jeśli odległość między membraną a szkłem jest większa, powracające fale będą mniej przesunięte i spowodują konstruktywną interferencję (patrz czerwona linia), co skutkuje jaśniejszym pikselem na końcowym obrazie. Wskazano typowe współczynniki załamania światła szkła, ośrodka i błony komórkowej, które określają wielkość odbicia.

Mikroskopia interferencyjno-refleksyjna ( IRM ), zwana także mikroskopią kontrastowo-interferencyjną ( RICM ) lub mikroskopią kontrastowo-kontrastową ( RCM ), w zależności od kontekstu, jest techniką mikroskopii optycznej , która wykorzystuje efekty interferencji do tworzenia obrazu obiektu na szklanej powierzchni. Intensywność sygnału jest miarą bliskości obiektu do powierzchni szkła . Technikę tę można wykorzystać do badania zdarzeń na błonie komórkowej bez użycia znacznika (fluorescencyjnego), jak ma to miejsce w przypadku mikroskop TIRF .

Historia i nazwa

W 1964 roku Adam SG Curtis ukuł termin Interference Reflection Microscopy ( IRM ), używając go w dziedzinie biologii komórki do badania zarodkowych fibroblastów serca kurcząt. Użył IRM, aby spojrzeć na miejsca adhezji i odległości fibroblastów, zauważając, że kontakt ze szkłem był głównie ograniczony do obwodu komórki i pseudopodiów .

W 1975 roku Johan Sebastiaan Ploem wprowadził ulepszenie IRM (opublikowane w rozdziale książki), które nazwał mikroskopią kontrastową odbicia ( RCM ). Ulepszeniem jest zastosowanie tzw. obiektywu anty-flex oraz skrzyżowanych polaryzatorów w celu dalszej redukcji światła rozproszonego w układzie optycznym. Obecnie ten schemat jest głównie określany jako mikroskopia kontrastowa z interferencją odbicia ( RICM ), której nazwa została wprowadzona przez Bareitera-Hahna i Konrada Becka w 1979 roku.

Jednak termin IRM czasami opisuje konfigurację RICM. Wielość nazw używanych do opisania tej techniki spowodowała pewne zamieszanie i została omówiona już w 1985 roku przez Verschuerena.

Bareiter-Hahn i Konrad Beck skorelowali tę technikę z mikroskopią elektronową , wykazując, że różne linie komórek ssaków przylegają do szklanego podłoża w określonych ogniskowych miejscach adhezji.

Teoria

Aby utworzyć obraz dołączonej komórki, światło o określonej długości fali przepuszcza się przez polaryzator . To liniowo spolaryzowane światło jest odbijane przez rozdzielacz wiązki w kierunku obiektywu , który skupia światło na preparacie. Szklana powierzchnia odbija w pewnym stopniu światło spolaryzowane. Światło, które nie jest odbijane przez szkło, wniknie do komórki i zostanie odbite przez błonę komórkową. Mogą wystąpić trzy sytuacje. Po pierwsze, gdy membrana znajduje się blisko szkła, światło odbite od szkła jest przesunięte o połowę długości fali, dzięki czemu światło odbite od membrany będzie miało przesunięcie fazowe w porównaniu ze światłem odbitym od szkła fazy i dlatego znoszą się nawzajem ( interferencja ). Ta interferencja skutkuje ciemnym pikselem na końcowym obrazie (lewy przypadek na rysunku). Po drugie, gdy membrana nie jest przymocowana do szkła, odbicie od membrany ma mniejsze przesunięcie fazowe w porównaniu do światła odbitego od szkła, a zatem nie będą się one znosić, co skutkuje jasnym pikselem na obrazie ( prawy przypadek na rysunku). Po trzecie, gdy nie ma próbki, wykrywane jest tylko światło odbite od szkła, które pojawi się jako jasne piksele na ostatecznym obrazie.

Odbite światło powróci do rozdzielacza wiązki i przejdzie przez drugi polaryzator, który eliminuje światło rozproszone, zanim dotrze do detektora (zwykle kamery CCD ) w celu utworzenia ostatecznego obrazu. Polaryzatory mogą zwiększyć wydajność poprzez redukcję światła rozproszonego; jednak w nowoczesnej konfiguracji z czułym aparatem cyfrowym nie są one wymagane.

Teoria

Odbicie spowodowane jest zmianą współczynnika załamania, więc na każdej granicy część światła zostanie odbita. Wielkość odbicia jest określona przez współczynnik odbicia , zgodnie z następującą zasadą: ${\ displaystyle r_ {12} \!}$

${\ Displaystyle R_ {12} = {\ Frac {n_ {1} -n_ {2}} {n_ {1} + n_ {2}}}}$

Odbicie jest stosunkiem natężenia odbitego światła ( ( $} \!}$ ${$ \ $i$ ) :

${\ Displaystyle R = {\ Frac {I_ {r}} {I_ {i}}} = \ lewo \ lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}\right\rbrack ^{2}={r_{12}}^{2}}$

Używając typowych współczynników załamania światła dla szkła (1,50-1,54, patrz lista ), wody (1,31, patrz lista ), błony komórkowej (1,48) i cytozolu (1,35), można obliczyć ułamek światła odbijany przez każdą interfejs. Stopień odbicia wzrasta wraz ze wzrostem różnicy między współczynnikami załamania światła, co skutkuje dużym odbiciem od powierzchni międzyfazowej między szklaną powierzchnią a pożywką hodowlaną (mniej więcej równe wodzie: 1,31-1,33). Oznacza to, że bez kuwety obraz będzie jasny, natomiast po zamocowaniu kuwety różnica między medium a membraną powoduje duże odbicie, które jest lekko przesunięte w fazie, co powoduje interferencję światła odbitego od szkła. Ponieważ amplituda światła odbitego od granicy faz medium-membrana jest zmniejszona z powodu rozpraszania, dołączony obszar będzie wyglądał na ciemniejszy, ale nie całkowicie czarny. Ponieważ stożek światła skupiony na próbce powoduje powstanie różnych kątów padania światła, istnieje szeroki zakres wzorów interferencji. Kiedy wzory różnią się o mniej niż 1 długość fali (prążek zerowego rzędu), wzory zbiegają się, co skutkuje zwiększoną intensywnością. Można to uzyskać stosując obiektyw o aperturze numerycznej większej niż 1.

Wymagania

Aby obrazować komórki za pomocą IRM, mikroskop potrzebuje co najmniej następujących elementów: 1) źródła światła, takiego jak lampa halogenowa, 2) filtra optycznego (przepuszczającego niewielki zakres długości fal) oraz 3) rozdzielacza wiązki (który odbija 50% i przepuszcza 50% wybranej długości fali).

Źródło światła musi wytwarzać światło o dużym natężeniu, ponieważ wiele światła zostanie utracone przez rozdzielacz wiązki i samą próbkę. Różne długości fal dają różne obrazy IRM; Bereiter-Hahn i współpracownicy wykazali, że dla ich komórek PtK 2 światło o długości fali 546 nm dawało lepszy kontrast niż światło niebieskie o długości fali 436 nm. Istnieje wiele udoskonaleń podstawowej teorii IRM, z których większość zwiększa wydajność i wydajność tworzenia obrazu. Umieszczając polaryzatory i płytkę ćwierćfalową między rozdzielaczem wiązki a preparatem, światło spolaryzowane liniowo można przekształcić w światło spolaryzowane kołowo , a następnie ponownie przekształcone w światło spolaryzowane liniowo, co zwiększa wydajność systemu. Artykuł o polaryzatorze kołowym szczegółowo omawia ten proces. Ponadto, włączając drugi polaryzator, który jest obrócony o 90° w stosunku do pierwszego polaryzatora, można zapobiec przedostawaniu się rozproszonego światła do detektora, zwiększając stosunek sygnału do szumu (patrz rysunek 2 Verschueren).

Zastosowania biologiczne

Istnieje kilka sposobów wykorzystania IRM do badania próbek biologicznych. Wczesne przykłady zastosowań tej techniki koncentrowały się na adhezji i migracji komórek .

Fuzja pęcherzyków

Dwie komórki chromafinowe zobrazowane za pomocą DIC (po lewej) i IRM (po prawej).

Fuzja pęcherzyków wizualizowana za pomocą IRM. Pasek skali przedstawia 2 μm.

Niedawno technika ta została wykorzystana do badania egzocytozy w komórkach chromochłonnych . Podczas obrazowania za pomocą DIC komórki chromochłonne wyglądają jak okrągłe komórki z małymi wypukłościami. Kiedy ta sama komórka jest obrazowana za pomocą IRM, ślad komórki na szkle może być wyraźnie widoczny jako ciemny obszar z małymi wypukłościami. Kiedy pęcherzyki łączą się z błoną, pojawiają się jako małe jasne kółka w ciemnym śladzie (jasne plamy w górnej komórce na prawym panelu).

Przykład fuzji pęcherzyków w komórkach chromochłonnych przy użyciu IRM pokazano na filmie 1. Po stymulacji 60 mM potasem , w ciemnym śladzie komórki chromochłonnej zaczynają pojawiać się liczne jasne plamy w wyniku egzocytozy gęstych granulek rdzeniowych. Ponieważ IRM nie wymaga znacznika fluorescencyjnego, można go łączyć z innymi technikami obrazowania, takimi jak epifluorescencja i mikroskopia TIRF, w celu badania dynamiki białek wraz z egzocytozą i endocytozą pęcherzyków. Kolejną korzyścią wynikającą z braku znaczników fluorescencyjnych jest zmniejszona fototoksyczność .

Dalsza lektura

Ilościowa mikroskopia kontrastowa z interferencją odbicia (RICM) w miękkiej materii i adhezji komórkowej , Laurent Limozin i Kheya Sengupta, ChemPhysChem 2009, 10 , 2752–2768.

Linki zewnętrzne