Normalizacja Western blot
Normalizacja danych Western blot jest etapem analitycznym, który jest wykonywany w celu porównania względnej obfitości określonego białka na ścieżkach blot lub żelu w różnych eksperymentalnych zabiegach lub w różnych tkankach lub stadiach rozwojowych. Ogólnym celem normalizacji jest zminimalizowanie skutków wynikających ze zmienności błędów eksperymentalnych, takich jak niespójne przygotowanie próbki, nierówne obciążenie próbki na ścieżkach żelowych lub nierównomierny transfer białek, co może podważyć wnioski, które można uzyskać z analizy Western blot dane. Obecnie istnieją dwie metody normalizacji Western blot : (i) normalizacja białka podstawowego i (ii) normalizacja białka całkowitego.
Procedura
Normalizacja następuje bezpośrednio na żelu lub blottingu. Najpierw obrazuje się zabarwiony żel lub blot, rysuje się prostokąt wokół docelowego białka w każdej ścieżce i mierzy się intensywność sygnału wewnątrz prostokąta. Otrzymaną intensywność sygnału można następnie znormalizować w odniesieniu do intensywności sygnału obciążającej kontroli wewnętrznej wykrytej na tym samym żelu lub blocie. W przypadku stosowania barwników białkowych membranę można inkubować z wybranym barwnikiem przed lub po immunodetekcji, w zależności od rodzaju barwnika.
Kontrole białka domowego
Geny i białka porządkowe, w tym β-aktyna , GAPDH , HPRT1 i RPLP1 , są często używane jako kontrole wewnętrzne w Western blot ponieważ uważa się, że są wyrażane konstytutywnie, na tym samym poziomie, w różnych eksperymentach. Jednak ostatnie badania wykazały, że ekspresja białek metabolizmu podstawowego (HKP) może zmieniać się w różnych typach komórek i warunkach biologicznych. Dlatego wydawcy naukowi i agencje finansujące wymagają teraz wcześniejszej walidacji kontroli normalizacyjnych dla każdego eksperymentu, aby zapewnić powtarzalność i dokładność wyników.
Przeciwciała fluorescencyjne
W przypadku stosowania przeciwciał fluorescencyjnych do obrazowania białek w metodzie Western blot normalizacja wymaga od użytkownika zdefiniowania górnej i dolnej granicy oznaczania ilościowego oraz scharakteryzowania liniowej zależności między intensywnością sygnału a objętością masy próbki dla każdego antygenu. Zarówno białko docelowe, jak i kontrola normalizacyjna muszą wykazywać fluorescencję w dynamicznym zakresie wykrywania. Wiele HKP ulega ekspresji na wysokim poziomie i są one preferowane do stosowania z białkami docelowymi o wysokiej ekspresji. Białka wykazujące niższą ekspresję są trudne do wykrycia na tym samym blocie.
Przeciwciała fluorescencyjne są dostępne w handlu i zaleca się w pełni scharakteryzowane przeciwciała, aby zapewnić spójność wyników.
Gdy nie stosuje się detekcji fluorescencyjnej, białko kontroli ładowania i białko będące przedmiotem zainteresowania muszą znacznie różnić się masą cząsteczkową , aby można je było odpowiednio rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej w celu dokładnej analizy.
Zdzieranie membrany
Błony należy usunąć i ponownie sondować przy użyciu nowego zestawu przeciwciał wykrywających w przypadku wykrywania wielu celów białkowych na tym samym błocie. Nieskuteczne usuwanie może skutkować słabym sygnałem z białka docelowego. Aby zapobiec utracie antygenu, zaleca się tylko trzy inkubacje strippingowe na membranę. Całkowite wyeliminowanie sygnału z bardzo obfitych białek może być trudne, dlatego zaleca się, aby najpierw wykryć białka o niskiej ekspresji.
Egzogenne kontrole typu spike-in
Ponieważ poziomy HKP mogą być niespójne między tkankami, naukowcy mogą kontrolować białko będące przedmiotem zainteresowania, dodając czyste, egzogenne białko o znanym stężeniu w liniowym zakresie przeciwciała. W porównaniu z HKP dostępna jest szersza gama białek do kontroli z dodatkiem spike-in.
Normalizacja białka całkowitego
W normalizacji białka całkowitego (TPN), obfitość białka docelowego jest normalizowana do całkowitej ilości białka w każdej ścieżce. Ponieważ TPN nie jest zależny od pojedynczej kontroli ładowania, walidacja kontroli i usuwanie/ponowne sondowanie blotów w celu wykrycia HKP nie jest konieczne. Może to poprawić precyzję (do 0,1 µg białka całkowitego na ścieżkę), opłacalność i niezawodność danych.
Plamy fluorescencyjne i żele bez plam wymagają specjalnego sprzętu do wizualizacji białek na żelu/blocie. Plamy mogą nie pokrywać plamy równomiernie; więcej plam może zebrać się na brzegach plamy niż na środku. Niejednorodność obrazu może skutkować niedokładną normalizacją.
Plamy przed przeciwciałami
Barwniki anionowe, takie jak Ponceau S i błękit brylantowy Coomassie , oraz barwniki fluorescencyjne, takie jak Sypro Ruby i Deep Purple, są stosowane przed dodaniem przeciwciał, ponieważ nie wpływają one na dalszą immunodetekcję.
Ponceau S to ujemnie naładowany, odwracalny barwnik, który barwi białka na czerwonawo-różowy kolor i jest łatwo usuwany przez pranie w wodzie. Intensywność barwienia Ponceau S zmniejsza się szybko w czasie, dlatego dokumentację należy przeprowadzić szybko. Liniowy zakres do 140 µg jest zgłaszany dla Ponceau S ze słabą odtwarzalnością ze względu na wysoce zależną od czasu intensywność barwienia i niski stosunek sygnału do szumu.
Barwniki fluorescencyjne, takie jak Sypro Ruby, mają szeroki zakres liniowy i są bardziej czułe niż barwniki anionowe. Są to trwałe, fotostabilne plamy, które można uwidocznić za pomocą standardowego transiluminatora UV lub światła niebieskiego lub skanu laserowego. Membrany można następnie udokumentować na kliszy lub cyfrowo za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunkowym . Barwienie Sypro Ruby blot jest czasochłonne i ma tendencję do wysycania powyżej 50 μg białka na ścieżkę.
Plamy po przeciwciałach
Czerń amido jest powszechnie stosowanym trwałym barwnikiem anionowym po przeciwciałach, który jest bardziej czuły niż Ponceau S. Barwnik ten jest nakładany po immunodetekcji.
Technologia bez plam
Technologia plamoodporna wykorzystuje chemię w żelu do obrazowania. Ta reakcja chemiczna nie wpływa na transfer białek ani dalsze wiązanie przeciwciał. Nie obejmuje również etapów barwienia/odbarwiania, a intensywność prążków pozostaje stała w czasie.
Technologia plamoodporna nie wykrywa białek, które nie zawierają pozostałości tryptofanu . Do wykrycia potrzebne są co najmniej dwa tryptofany. Liniowy zakres normalizacji bez plam wynosi do 80 µg białka na ścieżkę dla 18-dołkowych i do 100 µg na ścieżkę dla 12-dołkowych średnich żeli Criterion. Ten zakres jest zgodny z typowymi ładunkami białka w ilościowych metodach Western blot i umożliwia obliczenia kontroli ładowania w szerokim zakresie obciążenia białkami. Niedawno pojawiła się również bardziej wydajna metoda usuwania plam. W przypadku stosowania produktów o dużej zawartości białka technologia plamoodporna okazała się skuteczniejsza niż plamy.