Obrazowanie fluorescencyjne

Wielobarwny obraz fluorescencyjny żywych komórek HeLa

Obrazowanie fluorescencyjne to rodzaj nieinwazyjnej techniki obrazowania, która może pomóc w wizualizacji procesów biologicznych zachodzących w żywym organizmie. Obrazy można wytwarzać różnymi metodami, w tym: mikroskopią , sondami obrazującymi i spektroskopią .

fluorescencja jest formą luminescencji , która wynika z emitowania przez materię światła o określonej długości fali po pochłonięciu promieniowania elektromagnetycznego . Cząsteczki, które ponownie emitują światło po absorpcji światła, nazywane są fluoroforami .

Obrazowanie fluorescencyjne fotografuje barwniki fluorescencyjne i białka fluorescencyjne w celu oznaczenia mechanizmów i struktur molekularnych. Pozwala eksperymentalnie obserwować dynamikę ekspresji genów , ekspresji białek i interakcji molekularnych w żywej komórce. Zasadniczo służy jako precyzyjne, ilościowe narzędzie dotyczące zastosowań biochemicznych.

Powszechnie błędne przekonanie, że fluorescencja różni się od bioluminescencji tym, w jaki sposób białka z każdego procesu wytwarzają światło. Bioluminescencja to proces chemiczny, w którym enzymy rozkładają substrat w celu wytworzenia światła. Fluorescencja to fizyczne wzbudzenie elektronu, a następnie powrót w celu wyemitowania światła.

Atrybuty

Mechanizm fluorescencji

Diagram przedstawiający związek między absorpcją a fluorescencją

Kiedy pewna cząsteczka pochłania światło, energia cząsteczki jest na krótko podnoszona do wyższego stanu wzbudzonego. Późniejszy powrót do stanu podstawowego powoduje emisję światła fluorescencyjnego, które można wykryć i zmierzyć. Emitowane światło, będące wynikiem zaabsorbowanego fotonu o energii hv , ma określoną długość fali. Ważne jest, aby znać tę długość fali z wyprzedzeniem, aby w trakcie eksperymentu urządzenie pomiarowe wiedziało, jaką długość fali należy ustawić, aby wykryć wytwarzanie światła. Ta długość fali jest określona przez równanie:

Gdzie h = stała Plancka, a c = prędkość światła. Zwykle do pomiaru intensywności i cyfrowego sfotografowania obrazu używa się dużego urządzenia skanującego lub CCD.

Barwniki fluorescencyjne a białka

Barwniki fluorescencyjne, bez czasu dojrzewania, zapewniają wyższą fotostabilność i jasność w porównaniu z białkami fluorescencyjnymi. Jeśli chodzi o jasność, jasność zależy od współczynnika ekstynkcji fluoroforów lub zdolności do pochłaniania światła oraz jego wydajności kwantowej lub skuteczności w przekształcaniu pochłoniętego światła w luminescencję emitującą fluorescencję. Same barwniki nie są bardzo fluorescencyjne, ale kiedy zwiążą się z białkami, stają się łatwiejsze do wykrycia. Jeden przykład, NanoOrange, wiąże się z powłoką i regionami hydrofobowymi białka, będąc jednocześnie odpornym na czynniki redukujące. Jeśli chodzi o białka, same te cząsteczki będą fluoryzować, gdy pochłoną określoną długość fali padającego światła. Jednym z przykładów tego jest zielone białko fluorescencyjne (GFP), które fluoryzuje na zielono po wystawieniu na działanie światła w zakresie od niebieskiego do UV. Białka fluorescencyjne są doskonałymi cząsteczkami reporterowymi, które mogą pomóc w lokalizacji białek, obserwowaniu wiązania białek i ilościowym określaniu ekspresji genów.

Zakres obrazowania

Ponieważ niektóre długości fal fluorescencji są poza zasięgiem ludzkiego oka, do dokładnego wykrywania światła i obrazowania emisji stosuje się urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Zwykle ma to miejsce w zakresie 300 – 800 nm. Jedną z zalet sygnalizacji fluorescencyjnej jest to, że intensywność emitowanego światła zachowuje się raczej liniowo w odniesieniu do ilości dostarczonych cząsteczek fluorescencyjnych. Jest to oczywiście warunkowe, że natężenie pochłanianego światła i długość fali są stałe. Jeśli chodzi o sam obraz, jest on zwykle zapisany w 12-bitowym lub 16-bitowym formacie danych.

Zielone białko fluorescencyjne (GFP) naświetlane w świetle UV u trzech myszy laboratoryjnych

Systemy obrazowania

Główne elementy systemów obrazowania fluorescencyjnego to:

  • Źródło wzbudzenia: urządzenie, które wytwarza źródło o dużej długości fali, takie jak światło UV, lub źródło o wąskiej długości fali, takie jak laser.
  • Optyka wyświetlacza świetlnego: mechanizm, którego światło oświetla próbkę. Zwykle odbywa się to poprzez bezpośrednie oświetlenie próbki.
  • Optyka asortymentu światła: metoda zbierania samego światła. Zwykle są to soczewki, lustra i filtry.
  • Filtracja emitowanego światła: filtry optyczne zapewniają, że światło odbite i rozproszone nie jest uwzględniane we fluorescencji. Trzy klasy filtrów emisji to filtry długoprzepustowe, krótkoprzepustowe i pasmowoprzepustowe.
  • Wykrywanie, wzmacnianie i wizualizacja: do wykrywania i ilościowego określania emitowanych fotonów używany jest fotopowielacz (PMT) lub urządzenie z parą ładunków (CCD)

Aplikacje

  • W PCR (elektroforezie w żelu agarozowym): SYBR Green jest bardzo powszechnym barwnikiem, który wiąże się z DNA i jest używany do wizualizacji prążków DNA w żelu agarozowym. Barwnik pochłania niebieskie światło i fluoryzuje na zielono, aby system obrazowania mógł je przechwycić.
  • Blotting (zachodni, północny i południowy): fluorochromy mogą wiązać się z przeciwciałami, RNA i DNA w celu fluorescencji i oceny ilościowej danych
  • Sekwencjonowanie DNA: Sekwencjonowanie Sangera to powszechna forma wykrywania kwasów nukleinowych, która może wykorzystywać znakowane fluorescencyjnie ddNTP do obrazowania pików fluorescencji
  • Chirurgia sterowana obrazem fluorescencyjnym: to podejście do obrazowania medycznego, które fluorescencyjnie oznacza masę, aby pomóc w nawigacji. Na przykład zieleń indocyjaninowa może być stosowana do wykrywania węzłów chłonnych u pacjentów z rakiem.
  • Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością do jednego nanometra (FIONA): wykorzystuje oświetlenie całkowitego wewnętrznego odbicia w celu zmniejszenia szumów i zwiększenia jasności fluoroforów
  • Obrazowanie wapnia: technika wykorzystująca cząsteczki fluorescencyjne zwane wskaźnikami wapnia, które zmieniają fluorescencję po związaniu z jonami Ca 2+ . Jest to kluczowy element pozwalający zobaczyć, kiedy komórki w układzie nerwowym są aktywne.
Żel agarozowy z bromkiem etydyny jako znacznikiem fluorescencyjnym w świetle UV

Rodzaje mikroskopii

Do zmiany wizualizacji i kontrastu obrazu można zastosować inny zestaw technik mikroskopowych. Każda metoda ma zalety i wady, ale wszystkie wykorzystują ten sam mechanizm fluorescencji do obserwacji procesu biologicznego.

  • Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia: technika mikroskopowa wykorzystująca zanikające fale do selektywnej obserwacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki.
  • Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem: Technika mikroskopii fluorescencyjnej, która oświetla cienki wycinek próbki pod prostopadłym kątem badania.
  • Mikroskopia obrazowania fluorescencji w czasie życia: technika obrazowania, która rejestruje zmiany fluorescencji w czasie

Zalety

  • Nieinwazyjne: obrazowanie in vivo może odbywać się bez konieczności nakłuwania skóry
  • Czułość: sondy są zaprojektowane tak, aby były niezwykle czułe na wykrywanie cząsteczek biologicznych, takich jak DNA, RNA i białka.
  • Wielokrotne znakowanie: w próbkach można wykryć wiele fluorochromów, co pozwala na łatwą integrację wzorców i kontroli.
  • Stabilność znakowanych cząsteczek: cząsteczki znakowane fluorescencyjnie stosowane w obrazowaniu mogą być przechowywane przez miesiące, podczas gdy inne cząsteczki, takie jak te znakowane radioaktywnie, rozkładają się w ciągu kilku dni.
  • Stosunkowo bezpieczny w obsłudze: większość fluoroforów można bezpiecznie i wystarczająco obsługiwać w rękawiczkach, podczas gdy na przykład radioizotopy mogą wymagać osłon ołowianych lub innej ochrony przed promieniowaniem.
  • Prosta utylizacja: wiele fluoroforów wymaga minimalnych metod utylizacji, podczas gdy odpady radioaktywne wymagają utylizacji regulowanej i długotrwałego postępowania. Pomaga to również w obniżeniu kosztów potrzebnych do wykorzystania tych produktów.

Niedogodności

Przykład mikroskopu fluorescencyjnego z urządzeniem ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) do przechwytywania obrazów
  • Fotowybielanie: powszechny problem z fluoroforami, w którym ciągłe cykle między stanem podstawowym a stanem wzbudzonym uszkadzają cząsteczkę i zmniejszają jej intensywność.
  • Wrażliwość środowiskowa: czynniki środowiskowe, takie jak temperatura, stężenie jonów i pH, mogą wpływać na wydajność i emisję fluorochromów
  • Toksyczność: fluorochromy Aome mogą być toksyczne dla komórek, tkanek, in vivo lub przez wytwarzanie mutacji.
  • Ograniczona zdolność rozdzielcza: mikroskopy fluorescencyjne mają ograniczoną zdolność rozróżniania bliskich obiektów na poziomie makroskopowym. Dla porównania, na przykład mikroskopy elektronowe mają zdolność rozdzielania w znacznie mniejszym zakresie.
  • Ograniczony początkowy zakres jasności: intensywność źródła światła padającego ma granicę i poza tym punktem może dojść do fotodestrukcji cząsteczek.

Ogólnie rzecz biorąc, ta forma obrazowania jest niezwykle przydatna w nowatorskich badaniach, ponieważ umożliwia monitorowanie procesów biologicznych. Przejście od obrazów fluorescencyjnych 2D do obrazów 3D umożliwiło naukowcom lepsze badanie przestrzennej precyzji i rozdzielczości. Ponadto, dzięki skoncentrowaniu wysiłków na analizie 4D, naukowcy są teraz w stanie monitorować komórkę w czasie rzeczywistym, umożliwiając im monitorowanie szybko zachodzących procesów.

Przyszłe kierunki

Różne kolory fluorescencji z zakresu białek fluorescencyjnych

Opracowanie skuteczniejszych białek fluorescencyjnych jest zadaniem, które podjęło wielu naukowców w celu ulepszenia możliwości sondy do obrazowania. Często mutacje w niektórych resztach mogą znacząco zmienić właściwości fluorescencyjne białka. Na przykład, poprzez mutację genu F64L w GFP meduzy, białko jest w stanie wydajniej fluoryzować w temperaturze 37°C, co jest ważną cechą podczas hodowli kultur w laboratorium. Oprócz tego inżynieria genetyczna może wytworzyć białko, które emituje światło o lepszej długości fali lub częstotliwości. Ponadto samo środowisko może odgrywać kluczową rolę. Czas życia fluorescencji można ustabilizować w środowisku polarnym.

Mechanizmy, które zostały dobrze opisane, ale niekoniecznie włączone do praktycznych zastosowań, mają obiecujący potencjał w obrazowaniu fluorescencyjnym. Rezonansowy transfer energii fluorescencji (FRET) jest niezwykle czułym mechanizmem, który wytwarza cząsteczki sygnałowe w zakresie 1-10 nm.

Ulepszenia w technikach składających się na procesy fluorescencyjne mają również kluczowe znaczenie dla wydajniejszych projektów. Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to technika analityczna, która obserwuje fluktuacje intensywności fluorescencji. Ta analiza jest elementem składowym wielu urządzeń do obrazowania fluorescencyjnego, a ulepszenia rozdzielczości przestrzennej mogą poprawić czułość i zasięg.

Opracowanie bardziej czułych sond i technik analitycznych do fluorescencji indukowanej laserem może pozwolić na uzyskanie dokładniejszych i aktualnych danych eksperymentalnych.

Zobacz też

Dalsza lektura

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fluorescence_imaging&oldid=1138647357 ”