Sekwencja aktywująca w górę
Sekwencja aktywująca w górę lub sekwencja aktywująca w górę (UAS) jest sekwencją regulatorową działającą w układzie cis . Różni się od promotora i zwiększa ekspresję sąsiedniego genu . Ze względu na swoją zasadniczą rolę w aktywowaniu transkrypcji, sekwencja aktywująca w górę jest często uważana za analogiczną do funkcji wzmacniacza u wielokomórkowych eukariontów. Sekwencje aktywacyjne w górę są kluczowym elementem indukcji, wzmacniając ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania poprzez zwiększoną aktywność transkrypcyjną. Sekwencja aktywacyjna w górę znajduje się w sąsiedztwie promotora minimalnego ( kasetka TATA ) i służy jako miejsce wiązania dla transaktywatorów . Jeśli transaktywator transkrypcji nie zwiąże się z UAS we właściwej orientacji, transkrypcja nie może się rozpocząć. Aby lepiej zrozumieć funkcję poprzedzającej sekwencji aktywacyjnej, korzystne jest zobaczenie jej roli w kaskadzie zdarzeń, które prowadzą do aktywacji transkrypcji. Ścieżka rozpoczyna się, gdy aktywatory wiążą się z celem w UAS rekrutując mediatora . Podjednostka białka wiążącego TATA czynnika transkrypcyjnego wiąże się następnie z blokiem TATA, rekrutując dodatkowe czynniki transkrypcyjne. Mediator następnie rekrutuje polimerazę RNA II do kompleksu przedinicjacyjnego. Po zainicjowaniu polimeraza RNA II jest uwalniana z kompleksu i rozpoczyna się transkrypcja.
Przykłady
GAL1-GAL10 (UAS G )
Właściwość GAL1-GAL10 do wiązania białka GAL4 jest wykorzystywana w technice GAL4/UAS do kontrolowanej nieprawidłowej ekspresji genów u Drosophila. Jest to najpopularniejsza forma ekspresji binarnej w Drosophila melanogaster , systemie, który został przystosowany do wielu zastosowań, aby Drosophila melanogaster stał się jednym z organizmów wielokomórkowych, które są najbardziej podatne na genetykę. W tej technice cztery powiązane miejsca wiązania między GAL10 i GAL1 w Saccharomyces cerevisiae służą jako element Upstream Activating Sequences (UAS) poprzez wiązanie GAL4 . Przeprowadzono kilka badań z Saccharomyces cerevisiae w celu zbadania dokładnej funkcji sekwencji aktywacyjnych w górę, często koncentrując się na wspomnianym regionie międzygenowym GAL1-GAL10 . Konsensus to 5'-CGG-N11 - CCG-3'.
W jednym badaniu zbadano reagującą na galaktozę sekwencję aktywacji w górę (UAS G ), przyglądając się wpływowi bliskości tego UAS na pozycjonowanie nukleosomu. Wybrano bliskość UAS, ponieważ delecje DNA otaczające UAS pozostawiły niezmieniony układ nukleosomów, co wskazuje, że pozycjonowanie nukleosomów nie było związane z interakcjami histon-DNA specyficznymi dla sekwencji. Rola poszczególnych regionów UAS G analizowano poprzez wstawienie oligonukleotydów o różnych właściwościach wiązania, co doprowadziło do udanej identyfikacji regionu odpowiedzialnego za utworzenie uporządkowanej macierzy. Zidentyfikowana sekwencja pokrywała się z miejscem wiązania GAL4 , które jest pozytywnym regulatorem transkrypcji, co pokrywa się z funkcją sekwencji aktywujących znajdujących się powyżej.
Inne badanie dotyczyło wpływu wstawienia UAS G do regionu promotora genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GPD) [1] . Ten promotor hybrydowy wykorzystano następnie do ekspresji ludzkiego interferonu odpornościowego, substancji toksycznej dla drożdży, która skutkuje zmniejszoną liczbą kopii i niską stabilnością plazmidu. W stosunku do promotora natywnego, ekspresja promotora hybrydowego była indukowana w hodowlach około 150- do 200-krotnie przez wzrost galaktozy, indukcja, która nie była widoczna w przypadku glukozy jako źródła węgla. W porównaniu z natywnym promotorem GPD obecność UAS G spowodował, że aktywność transkrypcyjna pozostała równoważnie zwiększona w warunkach indukowanych.
Sekwencja aktywacji w górę wrażliwa na inozytol (UAS INO )
Wrażliwa na inozytol sekwencja aktywacji upstream (UAS INO ) ma sekwencję konsensusową 5'-CATGTGAAAT-3' i jest obecna w regionach promotorowych genów kodujących enzymy biosyntezy fosfolipidów. Enzymy te są regulowane przez inozytol i cholinę, z których oba są prekursorami fosfolipidów. W obrębie tej konsensusowej sekwencji pierwszych sześć zasad jest homologicznych z kanonicznym motywem wiążącym dla białek w obrębie bHLH lub podstawowej helisa-pętla-helisa . Badania wykazały, że Ino2p i Ino4p, dwa białka regulatorowe bHLH z Saccharomyces cerevisiae wiążą się z fragmentami promotora zawierającymi ten element sekwencji konsensusowej. Zaprojektowano dodatkowe badania w celu bardziej szczegółowego zbadania funkcji UAS INO , głównie dlatego, że duża liczba aktywności enzymów biosyntetycznych fosfolipidów w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae wykazuje ten wspólny wzór ekspresji.
W jednym badaniu dokładniej zbadano interakcję między Ino4p i Ino2p, badając dimeryzację zachodzącą między nimi przed związaniem się z promotorem genu INO 1 i aktywacją transkrypcji. Wyizolowując 31 recesywnych supresorów mutanta ino 4-8 drożdży i określając, że 29 było w tym samym locus, naukowcy zidentyfikowali locus jako REG1 [2] . Jeden allel REG1 , mutant supresorowy sia1-1 , był w stanie stłumić auksotrofię inozytolu, ujawniając możliwą ścieżkę represji wrażliwych na inozytol genów zawierających sekwencję aktywującą powyżej drożdży.