Sekwencjonowanie RNA z rozdzielczością czasową
sekwencjonowania RNA z rozdzielczością czasową to zastosowania RNA-seq , które umożliwiają obserwacje obfitości RNA w czasie w próbce lub próbkach biologicznych. Sekwencjonowanie DNA drugiej generacji umożliwiło opłacalną, wysokowydajną i bezstronną analizę transkryptomu . Zwykle RNA-seq jest w stanie uchwycić migawkę transkryptomu tylko w momencie pobierania próbki. Wymaga to wielokrotnego pobierania próbek w wielu punktach czasowych, co zwiększa zarówno koszty finansowe, jak i czasowe eksperymentów. Innowacje metodologiczne i technologiczne umożliwiły analizę transkryptomu RNA w czasie bez konieczności wielokrotnego pobierania próbek w różnych punktach czasowych.
Tło
Podczas gdy DNA koduje wszystkie funkcjonalne elementy życia, zakodowana informacja musi zostać przekształcona w formę funkcjonalną. Zgodnie z centralnym dogmatem biologii molekularnej informacyjny RNA koduje informację genetyczną do produkcji białek, które obok funkcjonalnego RNA przeprowadzają większość procesów komórkowych niezbędnych do życia. Zmiany w obfitości RNA mogą być wykorzystywane jako pomiar zmian w zachowaniu komórek, takich jak stres cieplny , infekcja wirusem lub onkogeneza . Wiedza o tym, jak zmienia się transkryptom podczas procesów komórkowych, pozwala na lepsze zrozumienie dokładnych mechanizmów leżących u podstaw tych procesów.
Pierwotnie obfitość RNA w całym transkryptomie można było ocenić jedynie za pomocą metod, takich jak mikromacierze DNA lub seryjna analiza ekspresji genów (SAGE). Metody te są zaporowe pod różnymi względami; mikromacierze, choć tanie, dają niespójne wyniki, a SAGE opiera się na sekwencjonowaniu Sangera , co zapewnia ograniczoną przepustowość. Wykorzystując sekwencjonowanie drugiej generacji, zamiast mierzyć względną hybrydyzację sekwencji z sondami w przypadku mikromacierzy lub sekwencjonować krótkie segmenty w przypadku SAGE, badacz może po prostu sekwencjonować RNA w próbce i mierzyć względne obfitości określonych typów RNA przez porównując, ile razy każda cząsteczka RNA została zsekwencjonowana w danej próbce.
Zwykle w tradycyjnym eksperymencie RNA-seq, mikromacierzy lub SAGE RNA jest ekstrahowany z próbki biologicznej, takiej jak hodowane komórki , a RNA jest analizowane przy użyciu wybranej metody. Dane uzyskane z takiego eksperymentu odpowiadają obfitości RNA w danych warunkach doświadczalnych w czasie zbioru. W wielu zastosowaniach, takich jak porównywanie obfitości cząsteczek mRNA między komórkami wystawionymi na działanie leku i komórkami nie wystawionymi na działanie leku, ten typ podejścia eksperymentalnego jest wystarczający. Jednak wiele procesów komórkowych o znaczeniu naukowym i medycznym to procesy, które zachodzą w czasie, takie jak różnicowanie komórkowe lub fagocytoza . Badanie takich procesów wymaga analizy obfitości RNA w szeregu punktów czasowych.
Metody
Próbki szeregów czasowych
Przygotowanie próbek i przetwarzanie danych
Najprostszym podejściem do oceny obfitości RNA w czasie jest po prostu użycie wielu próbek, które są traktowane dokładnie w ten sam sposób, z wyjątkiem czasu trwania traktowania. Na przykład, aby zbadać proces biologiczny, który ma trwać godzinę, badacz może zaprojektować eksperyment, w którym proces jest wyzwalany przez pięć minut, 15 minut, 30 minut, 45 minut, jedną godzinę i dwie godziny w oddzielnej komórce próbki hodowli przed zebraniem komórek do analizy sekwencji RNA. Badacz miałby wtedy pomiary transkryptomu w każdym z tych punktów czasowych, a porównanie tych próbek wskazywałoby, które procesy komórkowe są aktywowane i dezaktywowane w czasie.
Silne strony
Ta metoda jest najbardziej powszechna do pomiaru RNA w czasie w modelach hodowli komórkowych, głównie ze względu na jej prostotę. Każda próbka biologiczna musi być przetwarzana dokładnie w ten sam sposób, a współczynnik czasu można łatwo dostosować w większości protokołów eksperymentalnych. Ponadto, ponieważ każdy punkt czasowy jest własną próbką, można zebrać więcej RNA i zsekwencjonować do badań.
Słabości
Wymóg wielu próbek do zbierania danych w rozdzielczości czasowej zwiększa koszt eksperymentu, a także wprowadza większy potencjał błędów technicznych. Chociaż cena masowo równoległego sekwencjonowania znacznie spadła od czasu jego wprowadzenia, prowadzenie badań RNA-seq na dużą skalę jest nadal zbyt drogie dla wielu laboratoriów. Ten problem jest potęgowany przez dodatkowe punkty czasowe zwiększające liczbę próbek o wielokrotność liczby punktów czasowych; użycie dwóch punktów czasowych zamiast jednego podwaja liczbę próbek wymaganych w eksperymencie. W konsekwencji wiele badań wykorzystujących szeregi czasowe RNA-seq jest ograniczonych pod względem wielkości próby, co zmniejsza się moc statystyczna lub liczba punktów czasowych, co zmniejsza ich rozdzielczość czasową, lub jedno i drugie. Wreszcie, wymagając większej liczby próbek biologicznych, istnieje większe ryzyko wpływu błędu ludzkiego na wyniki, co może prowadzić do błędnych wniosków
Oczyszczanie powinowactwa
Przygotowanie próbek i przetwarzanie danych
W tym podejściu próbki hodowli komórkowych są hodowane ze znakowanymi nukleotydami, które pozwalają na selektywne oczyszczanie nowo zsyntetyzowanych cząsteczek RNA. Jednym z popularnych podejść jest znakowanie impulsowe 4-tiourydyną (4-sU), analogiem uracylu , który jest włączany do nowo syntetyzowanych cząsteczek RNA. W tego typu eksperymencie badacz uzupełnia komórki 4-sU w czasie eksperymentu lub krótko przed nim. Kiedy leczenie eksperymentalne przypuszczalnie wpływa na ekspresję RNA, nowo zsyntetyzowany RNA byłby znakowany 4-sU. Nowo zsyntetyzowany RNA jest znakowany reaktywnym tiolem grupy, umożliwiając przyłączenie użytecznych cząsteczek do RNA. Biotyna jest popularną cząsteczką do stosowania w tego typu testach, ponieważ jest niedroga i wiąże się niezwykle silnie i selektywnie ze streptawidyną . Inkubacja biotynylowanego RNA z kulkami zawierającymi streptawidynę pozwala na selektywne oczyszczanie nowo zsyntetyzowanego RNA. Stąd nowo zsyntetyzowany i całkowity RNA sekwencjonuje się oddzielnie i porównuje pod kątem różnic.
Silne strony
Oczyszczanie metodą powinowactwa wykorzystuje niezwykle popularny układ biotyna-streptawidyna do frakcjonowania materiałów biologicznych. Wiązanie biotyny ze streptawidyną jest niezwykle silne (K d < 10-14 mol /L). Jest również wysoce specyficzny, co skutkuje minimalnym sygnałem tła z niespecyficznych zdarzeń wiązania. Ponadto rozdzielczość czasową uzyskuje się w pojedynczej próbce biologicznej, co skutkuje mniejszą zmiennością biologiczną w porównaniu z użyciem oddzielnych próbek dla każdego punktu czasowego.
Słabości
Słabości tej metody koncentrują się głównie na wydajności. Jedną z głównych trudności jest pobieranie 4-sU do hodowanych komórek. Jeśli 4-sU zostanie podane zbyt wcześnie, zostanie włączone do RNA, które nie zostało zsyntetyzowane, zanim komórka zaczęła reagować na warunki eksperymentu. Jeśli zostanie podany zbyt późno, eksperyment nie wychwyci wczesnych etapów odpowiedzi komórkowej. Szybkość wchłaniania 4-sU można zmierzyć, ale wymaga to dodatkowych eksperymentów w celu określenia optymalnej dawki i czasu. Ponadto parametry te należy mierzyć w określonych liniach komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, ponieważ różne linie komórkowe mogą pobierać 4-sU wolniej niż inne. Wiadomo, że RNA jest podatne na degradację in vitro . Często zdarza się, że protokoły eksperymentalne obejmujące RNA obejmują szereg kroków zmniejszających ryzyko rybonukleazy zanieczyszczenie lub spontaniczna degradacja próbek, ponieważ jakość RNA wpływa na wyniki seq RNA. Znakowanie metaboliczne obejmuje szereg dodatkowych etapów, które należy wykonać w laboratorium na RNA znajdującym się w roztworze. Ponieważ znakowanie metaboliczne wymaga przechowywania RNA niezamrożonego w płynnym roztworze, pewien poziom spontanicznej degradacji jest nieunikniony, chociaż zwykle nie ma to wpływu na wyniki w takim stopniu. Większe ryzyko wiąże się z ryzykiem zanieczyszczenia rybonukleazą, co uczyniłoby próbkę bezużyteczną, marnując czas i zasoby. Ważne jest, aby badacze pracujący z RNA w jakimkolwiek charakterze zminimalizowali niepotrzebne obchodzenie się z RNA z powodu tych zagrożeń. Dodatkową wadą stosowania tej metody jest to, że biorąc pod uwagę równoważną wielkość próbki, wymaganych jest więcej przebiegów sekwencjonowania w porównaniu z eksperymentem z szeregami czasowymi. Wynika to z faktu, że należy zsekwencjonować wiele próbek RNA odpowiadających początkowemu punktowi czasowemu.
Badania sugerują, że znakowanie 4-sU może samo w sobie powodować zmiany w transkrypcji, co wpłynęłoby na wszelkie wyniki uzyskane tą metodą.
Konwersja nukleotydów
Przygotowanie próbek i przetwarzanie danych
Konwersja nukleotydów polega na przekształcaniu niektórych nukleotydów w nowo zsyntetyzowanym RNA w inne, które można wykryć za pomocą sekwencjonowania. Timelapse-seq jest przykładem takiego podejścia. Podobnie jak w przypadku oczyszczania metodą powinowactwa, komórki inkubuje się z 4-sU. Po ekstrakcji RNA z próbek są one traktowane 2,2,2-trifluoroetyloaminą i nadjodanem sodu , który przekształca 4-sU w trifluoroetylocytozynę, analog cytozyny, który jest sekwencjonowany jako nukleotyd cytozyny zamiast uracylu. Podczas wyrównywania sekwencji i przetwarzania danych, konwersje U-do-C są wykorzystywane do ilościowego określenia liczby nowo zsyntetyzowanych transkryptów w porównaniu z masowym RNA.
Silne strony
Ta metoda ma wiele wspólnych zalet z oczyszczaniem powinowactwa; w szczególności fakt, że szeregi czasowe nie wymagają wielu próbek. Ta metoda eliminuje potrzebę wielu przebiegów sekwencjonowania dla wielu punktów czasowych, ponieważ wszystkie RNA są analizowane razem w aparacie do sekwencjonowania, a znakowany RNA jest oddzielany od nieznakowanego in silico . Zmniejsza to znacznie koszty sekwencjonowania, ponieważ teraz rozdzielczość czasową można uzyskać bez potrzeby dodatkowych próbek lub dodatkowych przebiegów sekwencjonowania. Ponadto, poprzez sekwencjonowanie wielu punktów czasowych razem, zmienność techniczna wprowadzona przez przetwarzanie próbki jest dodatkowo zmniejszana oprócz zmniejszonej zmienności biologicznej zapewnianej przez strategię eksperymentalną 4-sU.
Słabości
Podobnie jak w przypadku mocnych stron, ta metoda ma wiele wspólnych słabości z metodami oczyszczania powinowactwa. W szczególności pobór 4-sU i zwiększona obsługa próbek. Ponieważ Timelapse-seq opiera się na metodach chemii syntetycznej do konwersji nukleotydów, niekompletne reakcje skutkują niedoszacowaniem obfitości nowo zsyntetyzowanego RNA i mogą skutkować zmiennością między próbkami.
Powstające sekwencjonowanie transkryptów
Przygotowanie próbek i przetwarzanie danych
W przeciwieństwie do znakowania metabolicznego, sekwencjonowanie powstających transkryptów (NET-seq) bezpośrednio sekwencjonuje transkrypty, które wciąż przechodzą transkrypcję przez polimerazę RNA II . Metoda ta pozwala na badanie dynamiki elongacji transkrypcji , co nie jest możliwe w przypadku technik znakowania metabolicznego. W eksperymencie NET-seq komórki traktuje się jak w standardowym eksperymencie RNA-seq, dopóki nie zostaną poddane lizie . Lizę przeprowadza się w taki sposób, że kompleksy RNA-białko pozostają nienaruszone, a polimeraza RNA II ulega immunoprecypitacji z lizatu. RNA, który przechodził transkrypcję z DNA, jest nadal przyłączony do polimerazy RNA, a następnie jest eluowany z polimerazy i sekwencjonowany.
Silne strony
Ponieważ NET-seq wyodrębnia transkrypty, które nie zakończyły transkrypcji, możliwe jest uzyskanie rozdzielczości pojedynczego nukleotydu na ostatnio zsyntetyzowanym nukleotydzie transkryptów. Jest to cenne w badaniu zjawisk takich jak kinetyka transkrypcji . Ponadto pozwala na badanie niestabilnych transkryptów, które ulegają degradacji wkrótce po transkrypcji. Ogólne podejście do immunoprecypitacji białek wiążących RNA jest bardzo przydatne w zrozumieniu innych dziedzin biologii RNA, takich jak splicing .
Słabości
Metoda ta opiera się na immunoprecypitacji polimerazy RNA II. Istnieje wiele problemów z immunoprecypitacją, w tym niespecyficzne interakcje wiązania, które mogą skutkować immunoprecypitacją cząsteczek RNA poza celem. Rozdzielczość czasowa NET-seq jest ograniczona do wydłużenia transkrypcji. Chociaż możliwe jest porównywanie względnych obfitości między transkryptami przy użyciu NET-seq, nie jest to celem tej metody.
Przyszłe kierunki
Poza próbkowaniem szeregów czasowych obecnie nie ma metod pozwalających na porównywanie więcej niż dwóch punktów czasowych. Eksperymenty ze znakowaniem metabolicznym umożliwiają jedynie porównanie obfitości RNA przed i po znakowaniu impulsowym. Interesująca jest możliwość obserwowania modyfikacji transkryptomu w szeregu punktów czasowych w pojedynczej próbce, ponieważ zapewniłoby to zwiększoną rozdzielczość czasową w badaniach. W tym celu interesujące są istniejące metody znakowania metabolicznego; jeśli w różnych punktach czasowych zastosowano wiele różnych znaczników metabolicznych, może to pozwolić na zbadanie pośrednich punktów czasowych. Jednak takie podejście należy opracowywać ostrożnie, ponieważ błędy w metodach znakowania i etapach przetwarzania próbek mogą przyczynić się do błędnych wyników, jeśli porównuje się dane z różnych metod.
Doniesiono, że znakowanie metaboliczne za pomocą 4-sU wpływa na fenotyp komórkowy . W obecnej praktyce jest to nieuniknione i tolerowane, ponieważ uzyskane dane nadal pasują do aktualnych modeli biologicznych, a także fakt, że w większości przypadków próbki 4-sU są porównywane z próbkami 4-sU. Może to jednak prowadzić do fałszywych wniosków, zwłaszcza jeśli istnieje jakakolwiek interakcja między efektem 4-sU a wybranymi warunkami eksperymentu. Nie jest możliwe rozróżnienie różnic w poziomach RNA, które wynikają z badanych warunków eksperymentalnych lub są wynikiem traktowania 4-sU. Identyfikacja chemikaliów do znakowania, które nie wpływają na fenotyp komórkowy, całkowicie wyeliminowałaby te problemy.