Sekwencjonowanie magnetyczne pojedynczych cząsteczek
Sekwencjonowanie magnetyczne to opracowywana metoda sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek . Spinka do włosów DNA zawierająca interesującą sekwencję jest przyczepiona między kulką magnetyczną a szklaną powierzchnią. Pole magnetyczne jest przykładane do rozciągnięcia spinki do włosów w pojedyncze pasma, a spinka do włosów ponownie się zwija po zmniejszeniu pola magnetycznego. Długość spinki do włosów można określić przez bezpośrednie obrazowanie pierścieni dyfrakcyjnych kulek magnetycznych za pomocą prostego mikroskopu. Sekwencje DNA określa się przez pomiar zmian długości spinki do włosów po udanej hybrydyzacji komplementarnych nukleotydów.
Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek a sekwencjonowanie nowej generacji
Wraz z rozwojem różnych platform sekwencjonowania nowej generacji nastąpiła znaczna redukcja kosztów i wzrost przepustowości sekwencjonowania DNA. Jednak większość technologii sekwencjonowania opiera się na PCR klonalnej amplifikacji cząsteczki DNA w celu doprowadzenia sygnału do wykrywalnego zakresu. Sekwencjonowanie amplifikowanych klastrów lub sekwencjonowanie masowe w takim przypadku proponuje problem fazowania zależny od długości odczytu. Podczas każdego cyklu nie wszystkie cząsteczki w masie mają pomyślne włączenie dodatkowego nukleotydu. Przy zwiększonym cyklu sekwencjonowania sygnał opóźnionych cząsteczek ostatecznie przytłoczy prawdziwy sygnał. Problem fazowania jest głównym ograniczeniem długości odczytu technologii sekwencjonowania nowej generacji. W związku z tym istnieje zwiększone zainteresowanie opracowywaniem technologii sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek, w których nie jest wymagana amplifikacja. To nie tylko skraca czas przygotowania bibliotek do sekwencjonowania, ale ma również potencjał do osiągnięcia znacznie dłuższych odczytów, ponieważ opóźnione cząsteczki z nieudanymi rozszerzeniami można zignorować lub rozważyć osobno. Wcześniej znane technologie sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek obejmują Sekwencjonowanie Nanopore (Oxford Nanopore), sekwencjonowanie SMRT ( Pacific Biosciences ) i sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki Heliscope ( Helicos Biosciences ).
Magnetyczna detekcja oligonukleotydów zhybrydyzowanych ze szpilką DNA
Generacja szpilki do włosów DNA
Interesująca cząsteczka DNA musi być umieszczona w spince do włosów i przymocowana z jednej strony do kulki magnetycznej, az drugiej do nieruchomej szklanej powierzchni. Spinka do włosów jest przymocowana do powierzchni szkła za pomocą digoksygenina -antydygoksygenina. Kulka magnetyczna jest przyczepiona do przeciwległego końca poprzez biotyny ze streptawidyną . Takie ustawienie szpilki DNA można wykonać na dwa sposoby:
- 1) W przypadku cząsteczek dwuniciowego DNA (do sekwencjonowania całego genomu lub sekwencjonowania ukierunkowanego), fragment DNA jest ligowany z pętlą DNA na jednym końcu i strukturą widełek DNA, znakowaną biotyną i digoksygeniną na dwóch końcach.
- 2) W przypadku RNA-seq mRNA można uwięzić na kulkach powleczonych poli-T, gdzie na kulkach przeprowadza się reakcję odwrotnej transkrypcji w celu wytworzenia spinki do włosów cDNA .
Pomiar długości spinki do włosów
Nad szkiełkiem z próbką umieszcza się elektromagnesy, a poniżej odwrócony mikroskop . Obraz jest rejestrowany przez kamerę CCD i przesyłany do komputera, gdzie określane są trójwymiarowe pozycje kulek magnetycznych. Położenie kulki w płaszczyźnie poziomej szkiełka podstawowego, x i y, jest określane przez korelację obrazów kulek w czasie rzeczywistym. Pionowa długość spinki do włosów, mierzona pionowym położeniem dołączonej kulki magnetycznej, jest mierzona na podstawie średnicy pierścienia dyfrakcyjnego kulki, która zwiększa się wraz z odległością.
Otwieranie i zamykanie szpilki DNA
Stała siła magnetyczna jest przykładana do rozpięcia spinki do włosów DNA, a zmniejszenie siły umożliwia ponowne zapięcie spinki do włosów. Przed wykonaniem dalszych aplikacji wykonuje się kilka cykli rozpakowywania i ponownego zamykania. Podczas gdy siła magnetyczna wymagana do rozpakowania i ponownego zapięcia może się różnić w zależności od sekwencji DNA i długości szpilki do włosów, ich bezwzględne wartości nie są krytyczne, o ile są spójne w przebiegu sekwencjonowania.
Wykrywanie zdarzeń hybrydyzacji
Kiedy spinka do włosów DNA jest rozpinana w pojedynczą nić, oligonukleotydy komplementarne do sekwencji spinki do włosów mogą hybrydyzować. W trakcie procesu ponownego zamykania związane oligonukleotydy powodują przejściowe blokady. Pomiar długości spinki do włosów w czasie pozwala na określenie dokładnej pozycji hybrydyzacji, jak również obecności niedopasowań między oligonukleotydem a spinką do włosów.
Zastosowania do wykrywania długości szpilki do włosów w sekwencjonowaniu
Sekwencjonowanie przez hybrydyzację
Hybrydyzacja jest jednym ze sposobów określenia sekwencji nici DNA na podstawie wykrywania zmian długości spinki do włosów. Kiedy sonda hybrydyzuje z otwartą szpilką do włosów, całkowite ponowne zwinięcie spinki do włosów zostaje zatrzymane i można wywnioskować pozycję zhybrydyzowanej sondy. Tak więc sekwencję interesującego fragmentu DNA można wywnioskować z nakładania się pozycji zestawów sond, które mogą hybrydyzować jedna po drugiej.
Generowanie sekwencji 8-nt
Po pierwsze, fragment DNA można przekształcić w nową sekwencję, w której każdy oryginalny nukleotyd jest kodowany przez specyficzną sekwencję 8-nt (A8, T8, G8 i C8), a następnie zligowany ze szpilką do włosów.
Hybrydyzacja oligonukleotydów A8, T8, C8, G8
Po przyłożeniu siły magnetycznej, w stanie rozpiętej spinki do włosów, niewielka liczba rozróżniających nukleotydów może hybrydyzować z nowymi indywidualnymi komplementarnymi sekwencjami na spince do włosów, co może przejściowo blokować ponowne zwijanie się spinki do włosów.
Pozycje na mapie
Identyfikację pozycji blokady spinki do włosów wytworzonej przez hybrydyzację dyskryminujących nukleotydów można zaobserwować jako przerwy w czasie pomiaru odległości spinki do włosów. Całą sekwencję można zrekonstruować za pomocą nakładających się fragmentów.
Sekwencjonowanie przez ligację
Innym zastosowaniem sekwencjonowania magnetycznego jest wykorzystanie odległości od końca do końca spinki do włosów do wykrywania kolejnych ligacji oligonukleotydu. Pierwszym etapem sekwencjonowania przez ligację jest użycie startera do wydłużenia fragmentu DNA. Najpierw próbuje się wydłużyć fragment rozpoczynający się od adeniny, który można zligować tylko wtedy, gdy następnym nukleotydem na przeciwnej nici jest tymina. Następnie próbuje się kolejno uzyskać fragmenty zaczynające się od cytozyny, guaniny i tyminy i cykl się powtarza. Pole magnetyczne jest uwalniane po każdej ligacji, a następnie mierzona jest długość przedłużonego startera. Po ligacji starter jest wydłużany o siedem zasad, co skutkuje wykrywalnym zwiększeniem odległości między końcami spinki do włosów. Po rozszczepieniu RNazą w pozycji 2 następuje ligacja w celu przygotowania następnego cyklu ligacji, tak że następna ligacja jest umieszczona tuż przed poprzednią.
Biblioteka starterów 7nt
Bibliotekę starterów 7-nt, 5′-NNNNNNrX-3′, stosuje się w ligacji krótkiej zdegenerowanej fragmentiny oligonukleotydowej, w której N oznacza dowolny z czterech dezoksyrybonukleotydów , a Nr oznacza dowolny z czterech rybonukleotydów , X oznacza testowaną zasadę ( A, G, C, T). Bada się ligację z nicią startera każdej z czterech testowanych zasad w cyklach otwierania i zamykania szpilki do włosów.
Ligacja
Ligaty starterów 7-nt w stanie otwartym spinki do włosów, co zablokuje ponowne zapięcie ostatnich siedmiu nukleotydów i zwiększy odległość między powierzchnią a kulką magnetyczną o ~ 5 nm. Jeśli ligacja nie powiedzie się, nie obserwuje się zmiany długości szpilki do włosów.
RNaza
RNazą ostatnich sześciu nukleotydów jest kolejnym krokiem po ligacji, ostatecznie wydłużającym nić startera o pojedynczą zasadę. Takie rozszczepienie umożliwia ponowne zapięcie 6 nukleotydów spinki do włosów, sygnalizowane zmniejszeniem długości spinki do włosów o ~ 4 nm. Dlatego włączenie komplementarnego nukleotydu jest wskazane przez wzrost o 7 nukleotydów (+5 nm), a następnie spadek o 6 nukleotydów (-4 nm).
Kinaza
Po rozszczepieniu przez RNazę ostatnich sześciu nukleotydów, kolejnym etapem jest fosforylacja końca 5' przez Kinazę . Następnie można powtórzyć kolejny cykl ligacji.
Zalety metody magnetycznej w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek
Charakter wykrytego sygnału
Wiele konkurencyjnych metod sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek polega na włączeniu nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie. W sekwencjonowaniu nowej generacji sygnał fluorescencji klastrów można łatwo wykryć. Jednak gdy ta sama koncepcja zostanie zastosowana do sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek, największa komplikacja wynika z wysokiego poziomu błędów. Ponieważ trudno jest wykryć pojedyncze znakowane cząsteczki, platformy te mają niski stosunek sygnału do szumu, co często skutkuje błędnym wykrywaniem lub brakiem wykrywania sygnałów fluorescencyjnych. W przypadku sekwencjonowania magnetycznego mierzonym sygnałem są zmiany odległości między dwoma końcami spinki do włosów. Taki sygnał można łatwo wykryć za pomocą standardowych kamer. W ten sposób sygnały są łatwiejsze do wykrycia, nawet bez użycia drogich urządzeń do obrazowania.
Złagodzenie ograniczeń eksperymentalnych dla dyskryminacji pojedynczych nukleotydów
Oprócz charakteru wykrywanego sygnału, inne implementacje w tej platformie pozwalają na jeszcze wyższy stosunek sygnału do szumu. W przypadku sekwencjonowania magnetycznego przez hybrydyzację stosuje się zestaw nakładających się płytek tak, że sekwencja każdego nukleotydu jest określana przez hybrydyzację 8-meru. Dlatego instrument wymaga jedynie czułości do wykrycia zmiany ~ 6 nm (długość 8 nukleotydów). Podobnie, w przypadku sekwencjonowania przez cykle ligacji, pomyślne włączenie charakteryzuje się wzrostem o ~ 5 nm (ligacja 7-meru), po którym następuje spadek długości spinki do włosów o ~ 4 nm (rozszczepienie RNazą 6-meru). W tym przypadku zmniejszenie długości w drugim etapie stanowi dodatkowe potwierdzenie otrzymanego sygnału.
Względy techniczne
Rezolucja
Przy obecnych metodach błąd instrumentalny mierzonej długości spinki do włosów wynosi 1-1,5 nm. Długość pary zasad, czyli 2 wydłużonych jednoniciowych nukleotydów, wynosi około 0,85 nm. Dlatego rozdzielczość systemu wynosi kilka nukleotydów. Źródła hałasu wynikają z zależnych od długości ruchów Browna koralika zakotwiczonego przez rozciągniętą szpilkę do włosów, błędu statystycznego w określaniu położenia koralika i powolnych dryfów mechanicznych. Jednak, jak wspomniano wcześniej, taka rozdzielczość jest wystarczająca dla obecnej metody sekwencjonowania, ponieważ mierzone są zmiany > 4 nm.
Wydajność
Dzięki zastosowaniu pułapek magnetycznych można równolegle zastosować stałą siłę magnetyczną do milionów kulek magnetycznych połączonych szpilką do włosów DNA. Siłę magnetyczną można łatwo regulować, zmieniając odległość między pułapką a kulkami magnetycznymi. Liczba ead, które mogą być jednocześnie monitorowane, która określa przepustowość odczytu tej platformy, jest ograniczona rozmiarem kulki, długością spinki do włosów na uwięzi DNA i limitem rozdzielczości optycznej. Obecnie można osiągnąć gęstość 750 K/mm 2 (porównywalną z Illumina HiSeq 2000).
Długość odczytu
Jak wspomniano powyżej, szum spowodowany fluktuacjami Browna kulki zwiększa się wraz z długością. Nie przeprowadzono jeszcze solidnych testów sekwencjonowania, aby określić maksymalną długość odczytu tego systemu. Jednak z powodzeniem wykryto ligację 7-meru w środku spinki do włosów o długości 1241 nukleotydów, co sugeruje, że obecny system jest wystarczający do sekwencjonowania do ~ 500 pz.
Dodatkowe ograniczenia
Szybkość sekwencjonowania lub obrazowania zależy od mechanicznej prędkości ruchu kulek magnetycznych, która jest ograniczona siłą oporu. Obecnie można zmierzyć 10 cykli otwarcia-zamknięcia spinki do włosów na sekundę. Dodatkowe komplikacje obejmują istnienie drugorzędowej struktury spinki do włosów w DNA będącym przedmiotem zainteresowania. W takim przypadku pętla DNA, która ma być poddana ligacji, musi być zaprojektowana w taki sposób, aby jej zamknięcie było korzystniejsze niż zamknięcie pętli endogennej w DNA będącym przedmiotem zainteresowania.