Sekwencjonowanie transpozonów

Sekwencjonowanie insercji transpozonu ( Tn-seq ) łączy mutagenezę insercyjną transpozonu z masowo równoległym sekwencjonowaniem (MPS) miejsc insercji transpozonu w celu identyfikacji genów przyczyniających się do funkcji będącej przedmiotem zainteresowania bakterii . Metoda została pierwotnie opracowana w wyniku równoczesnej pracy w czterech laboratoriach pod akronimami HITS, INSeq, TraDIS i Tn-Seq. Liczne odmiany zostały następnie opracowane i zastosowane w różnych systemach biologicznych. Łącznie metody są często określane jako Tn-Seq, ponieważ wszystkie obejmują monitorowanie sprawności mutantów z insercją transpozonu za pomocą metod sekwencjonowania DNA.

Transpozony to wysoce regulowane, oddzielne segmenty DNA , które mogą przemieszczać się w obrębie genomu. Są uniwersalne i znajdują się w Eubacteria , Archaea i Eukarya , w tym u ludzi. Transpozony mają duży wpływ na ekspresję genów i może być wykorzystany do określenia funkcji genów. W rzeczywistości, kiedy transpozon wprowadzi się do genu, funkcja genu zostanie zakłócona. Ze względu na tę właściwość transpozony zostały zmanipulowane w celu zastosowania w mutagenezie insercyjnej. Rozwój sekwencjonowania genomu drobnoustrojów był dużym postępem w stosowaniu mutagenezy transpozonowej. Funkcję, na którą wpływa wstawienie transpozonu, można powiązać z uszkodzonym genem przez sekwencjonowanie genomu w celu zlokalizowania miejsca wstawienia transpozonu. Masowo równoległe sekwencjonowanie umożliwia jednoczesne sekwencjonowanie miejsc insercji transpozonu w dużych mieszaninach różnych mutantów. Dlatego analiza całego genomu jest możliwa, jeśli transpozony są umieszczone w całym genomie w kolekcji mutantów.

Sekwencjonowanie transpozonów wymaga stworzenia biblioteki insercji transpozonów, która będzie zawierać grupę mutantów, które łącznie mają insercje transpozonów we wszystkich nieistotnych genach. Biblioteka jest hodowana w interesujących warunkach eksperymentalnych. Mutanty z transpozonami wstawionymi do genów wymaganych do wzrostu w warunkach testowych będą się zmniejszać w populacji. Aby zidentyfikować utracone mutanty, sekwencje genomowe przylegające do końców transpozonu amplifikuje się metodą PCR i sekwencjonowano przez MPS w celu określenia lokalizacji i liczebności każdej mutacji insercyjnej. Znaczenie każdego genu dla wzrostu w warunkach testowych określa się przez porównanie obfitości każdego mutanta przed i po wzroście w warunkach testowych. Tn-seq jest przydatny zarówno do badania sprawności pojedynczego genu, jak i interakcji genów

Mutageneza ze znacznikiem sygnaturowym (STM) to starsza technika, która obejmuje również łączenie mutantów insercyjnych transpozonów w celu określenia znaczenia uszkodzonych genów w selektywnych warunkach wzrostu. Wersje STM o wysokiej przepustowości wykorzystują mikromacierze genomowe, które są mniej dokładne i mają niższy zakres dynamiki niż masowo-równoległe sekwencjonowanie. Wraz z wynalezieniem sekwencjonowania nowej generacji dane genomiczne stały się coraz bardziej dostępne. Jednak pomimo wzrostu danych genomicznych nasza wiedza na temat funkcji genów pozostaje czynnikiem ograniczającym nasze zrozumienie roli, jaką odgrywają geny. Dlatego konieczne było zastosowanie podejścia o wysokiej przepustowości do badania relacji genotyp-fenotyp, takich jak Tn-seq.

Metodologia

Sekwencjonowanie transpozonów rozpoczyna się od transdukcji populacji bakterii z elementami transpozonowymi przy użyciu bakteriofagów . Tn-seq wykorzystuje transpozon Himar I Mariner, powszechny i ​​stabilny transpozon. Po transdukcji DNA jest cięte a wstawiona sekwencja jest amplifikowana przez PCR . Miejsca rozpoznawane dla MmeI, endonukleazy restrykcyjnej typu IIS , można wprowadzić przez zmianę pojedynczego nukleotydu w końcowych powtórzeniach Marinera . To znajduje się 4 pary zasad przed końcem powtórzenia końcowego.

Mmel wykonuje przesunięte cięcie o 2 pary zasad 20 zasad poniżej miejsca rozpoznania .

Kiedy Mmel trawi DNA z biblioteki mutantów z insercją transpozonu , powstaje pofragmentowany DNA zawierający lewy i prawy transpozon oraz 16 par zasad otaczającego genomowego DNA. Fragment o długości 16 par zasad wystarczy do określenia miejsca wstawienia transpozonu w genomie bakteryjnym. Podwiązanie adaptera jest ułatwione przez 2 nawis podstawy . Starter specyficzny dla adaptera i starter specyficzny dla transpozonu są używane do amplifikacji sekwencji poprzez PCR. Produkt o 120 parach zasad jest następnie izolowany przy użyciu żelu agarozowego lub PAGE . Masowo równoległe sekwencjonowanie jest następnie wykorzystywane do określenia sekwencji flankujących 16 par zasad .

Funkcja genu jest wywnioskowana po przyjrzeniu się wpływowi wstawienia na funkcję genu w określonych warunkach .

Zalety i wady

W przeciwieństwie do wysokowydajnej ścieżki insercyjnej przez głębokie sekwencjonowanie (HITS) i sekwencjonowanie miejsca insercji kierowane przez transpozon (TraDIS) [ , Tn-seq jest specyficzny dla transpozonu Himar I Mariner i nie może być stosowany do innych transpozonów lub elementów insercyjnych. Jednak protokół dla Tn-seq jest mniej czasochłonny . HITS i TraDIS wykorzystują cięcie DNA technikę, która pozwala uzyskać szereg rozmiarów produktów PCR , co może spowodować, że krótsze matryce DNA będą preferencyjnie amplifikowane w porównaniu z dłuższymi matrycami. Tn-seq wytwarza produkt o jednolitej wielkości, zmniejszając w ten sposób możliwość błędu PCR.

Tn-seq można wykorzystać zarówno do identyfikacji sprawności pojedynczych genów, jak i do mapowania interakcji genów w mikroorganizmach. Istniejące metody tego typu badań są zależne od istniejących wcześniej mikromacierzy genomowych lub macierzy z nokautem genów, podczas gdy Tn-seq nie. Wykorzystanie masowo równoległego sekwencjonowania przez Tn-seq sprawia, że ​​ta technika jest łatwa do odtworzenia, czuła i niezawodna.

Aplikacje

Tn-seq okazał się użyteczną techniką identyfikacji nowych funkcji genów. Wysoce czuła natura Tn-seq może być wykorzystana do określenia zależności fenotyp-genotyp, które mogły zostać uznane za nieistotne przy użyciu mniej czułych metod. Zespół Tn-seq zidentyfikował podstawowe geny i szlaki, które są ważne dla wykorzystania cholesterolu przez Mycobacterium tuberculosis .

Tn-seq został wykorzystany do badania organizacji genomu wyższego rzędu przy użyciu interakcji genów. Geny funkcjonują jako wysoce powiązana sieć . Dlatego, aby zbadać wpływ genu na fenotyp , należy również wziąć pod uwagę interakcje genów . Te sieci genów można badać, przeprowadzając badania przesiewowe pod kątem syntetycznej śmiertelności i interakcji genów, w których podwójny mutant wykazuje nieoczekiwaną wartość dopasowania w porównaniu z każdym indywidualnym mutantem . Tn-seq użyto do określenia interakcji genetycznych między pięcioma genami zapytania a resztą genomu Streptococcus pneumoniae, co ujawniło zarówno obciążające, jak i łagodzące interakcje genetyczne.

Tn-seq stosowane w połączeniu z RNA-seq można wykorzystać do zbadania roli niekodujących regionów DNA.