Separacja DNA metodą adsorpcji na krzemionce
Separacja DNA przez adsorpcję na krzemionce to metoda separacji DNA oparta na wiązaniu cząsteczek DNA z powierzchniami krzemionki w obecności pewnych soli iw określonych warunkach pH .
Operacje
W celu przeprowadzenia rozdziału DNA przez adsorpcję na krzemionce, próbka (może to być wszystko, od oczyszczonych komórek po próbkę tkanki) jest poddawana lizie , uwalniając białka , DNA , fosfolipidy itp. z komórek. Pozostała tkanka jest odrzucana. Supernatant zawierający DNA jest następnie eksponowany na krzemionkę w roztworze o wysokiej sile jonowej . Najwyższe wydajności adsorpcji DNA występują w obecności roztworu buforowego o pH równym lub niższym od pKa powierzchniowych grup silanolowych.
Mechanizm adsorpcji DNA na krzemionce nie jest w pełni poznany; jedno z możliwych wyjaśnień obejmuje zmniejszenie ujemnego ładunku powierzchni krzemionki dzięki wysokiej sile jonowej buforu. Ten spadek ładunku powierzchniowego prowadzi do zmniejszenia odpychania elektrostatycznego między ujemnie naładowanym DNA a ujemnie naładowaną krzemionką. Tymczasem bufor zmniejsza również aktywność wody poprzez formatowanie uwodnionych jonów. Prowadzi to do odwodnienia powierzchni krzemionki i DNA. Warunki te prowadzą do energetycznie korzystnej sytuacji, w której DNA adsorbuje się na powierzchni krzemionki. [ potrzebne źródło ]
Dalsze wyjaśnienie, w jaki sposób DNA wiąże się z krzemionką, opiera się na działaniu chlorku guanidyniowego (GuHCl), który działa jak chaotrop. Chaotrop denaturuje biomolekuły, niszcząc otaczającą je powłokę hydratacyjną. Pozwala to dodatnio naładowanym jonom na utworzenie mostka solnego między ujemnie naładowaną krzemionką a ujemnie naładowanym szkieletem DNA w wysokim stężeniu soli. DNA można następnie przemyć dużą ilością soli i etanolem, a ostatecznie eluować niską zawartością soli.
Po związaniu DNA z krzemionką jest ono przemywane w celu usunięcia zanieczyszczeń i ostatecznie eluowane przy użyciu buforu do elucji lub wody destylowanej. [ potrzebne źródło ]
Zobacz też
- Cady i in. Oczyszczanie kwasów nukleinowych za pomocą mikrofabrykowanych struktur krzemowych. Biosensors and Bioelectronics, 19, 59-66 (2003).
- KA Melzak, CS Sherwood, RFB Turner, CA Haynes. Siły napędowe adsorpcji DNA na krzemionce w roztworach nadchloranu. Journal of Colloid and Interface Science, 181, 635–644 (1996).
- Wolfe'a i in. W kierunku opartej na mikroczipie metody ekstrakcji do fazy stałej w celu izolacji kwasów nukleinowych. Electrophoresis, 23, 727-733 (2002).