Sztuczny czynnik transkrypcyjny
Sztuczne czynniki transkrypcyjne (ATF) to opracowane indywidualnie lub wielocząsteczkowe czynniki transkrypcyjne , które albo aktywują, albo hamują transkrypcję genów (biologia) .
ATF często zawierają dwa główne składniki połączone ze sobą, domenę wiążącą DNA i domenę regulatorową, znaną również jako domena efektorowa lub domena modulująca. Domena wiążąca DNA celuje w specyficzną sekwencję DNA z wysokim powinowactwem, a domena regulatorowa jest odpowiedzialna za aktywację lub represję związanego genu. ATF może bezpośrednio regulować ekspresję genów, może rekrutować białka i inne czynniki transkrypcyjne do inicjowania transkrypcji lub rekrutować białka i inne czynniki transkrypcyjne do zagęszczania DNA, co hamuje polimerazę RNA przed wiązaniem i transkrypcją DNA; przykład czynników transkrypcyjnych regulujących w górę ekspresję genów przedstawiono na rycinie 1 po lewej stronie. Ponieważ ATF składają się z dwóch oddzielnych składników, domeny wiążącej DNA i domeny regulacyjnej, te dwie domeny są wymienne, co pozwala na projektowanie nowych ATF z istniejących naturalnych czynników transkrypcyjnych.
Niektóre zastosowania ATF obejmują przeprogramowanie stanu komórki, leczenie raka i prawdopodobne leczenie zespołu Angelmana.
Projekt ATF
Domena wiążąca DNA
Domena wiążąca DNA kieruje ATF do określonej sekwencji genu. Naturalne białka wiążące DNA są powszechnie stosowane ze względu na ich wysokie powinowactwo do docelowej sekwencji DNA, jednak obecnie nie istnieje algorytm, który dopasowuje sekwencję aminokwasową białka do komplementarnej sekwencji wiążącej DNA, co ogranicza racjonalne projektowanie nowych białek wiążących DNA. Niedawno zbadano domeny niepeptydowe, oligonukleotydowe i poliamidowe wiążące DNA, co pozwala na racjonalne projektowanie. Rodzaj wybranej domeny wiążącej DNA zależy od pożądanego zastosowania ATF, wspólne domeny wiążące DNA przedstawiono w sekcji Rodzaje domen wiążących DNA ATF poniżej.
Domena regulacyjna
Domena regulatorowa jest odpowiedzialna za aktywację lub represję związanego genu i realizuje tę regulację poprzez bezpośrednią regulację ekspresji genów lub rekrutację innych białek i czynników transkrypcyjnych w celu zmiany poziomów transkrypcji. Jedną z dróg regulacji genu w górę jest rekrutacja przez ATF białek, które rozluźniają owijanie DNA wokół histonów, umożliwiając polimerazie RNA wiązanie i transkrypcję genu; podobnie sprasowanie DNA obniżyłoby ekspresję genów poprzez hamowanie wiązania polimerazy RNA. Domenami regulatorowymi promującymi transkrypcję genów są zwykle aktywatory kwasowe, złożone z aminokwasów kwaśnych i hydrofobowych, a domeny regulatorowe hamujące transkrypcję genów zwykle zawierają bardziej zasadowe aminokwasy. Czynniki wpływające na wpływ ATF na transkrypcję obejmują odległość domeny regulatorowej od miejsca transkrypcji, typ komórki oraz liczbę sekwencji aktywujących lub represyjnych obecnych w domenie regulatorowej. Domeny aktywujące, domeny regulatorowe, które promują transkrypcję genów, są często zdolne do zwiększania transkrypcji od 5 do 40-krotnie, a domeny regulatorowe RNA, jak wykazano, powodują 100-krotny poziom transkrypcji. Alternatywną strategią represji genów jest konkurowanie przez ATF z naturalnymi czynnikami transkrypcyjnymi i fizyczne blokowanie transkrypcji przez polimerazę RNA; jednak tworzenie ATF o wyższym powinowactwie do sekwencji DNA niż naturalne czynniki transkrypcyjne pozostaje wyzwaniem.
Wyrazy łączące
Łączniki kowalencyjnie lub niekowalencyjnie łączą domenę wiążącą DNA i domenę regulatorową. Często stosuje się łączniki peptydowe, ale istnieją również łączniki z glikolem polietylenowym i małymi cząsteczkami. Łączniki umożliwiają wymienność domen wiążących DNA i domen regulacyjnych, umożliwiając projektowanie nowych ATF ze składników naturalnych czynników transkrypcyjnych. Chociaż łączniki są mniej badane, długość łącznika jest ważna, ponieważ zmienia zakres wpływu domeny regulacyjnej na ekspresję genów.
Historia
Większość ATF została skonstruowana poprzez wymianę istniejących domen wiążących DNA i domen regulacyjnych w celu wygenerowania ATF z nowymi miejscami docelowymi i konsekwencjami regulacji transkrypcji. Badane są zaprojektowane domeny wiążące DNA, takie jak CRISPR-Cas, z nowymi możliwościami kierowania, aby uzyskać wyższą specyficzność i kontrolować potencjalne skutki uboczne. W przyszłości dużym zainteresowaniem cieszą się ATF, które mogą reagować na sygnały fizjologiczne, zmieniać poziomy transkrypcji tylko w określonym typie komórek i mogą być łatwo dostarczane bez użycia elektroporacji.
Rodzaje domen wiążących DNA ATF
CRISPR-Cas
zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych - Cas ( CRISPR -Cas) był szeroko badany w celu ukierunkowania na określoną sekwencję DNA przy użyciu pojedynczego prowadzącego RNA (sgRNA). W zastosowaniach ATF system CRISPR-Cas jest modyfikowany w celu dezaktywacji naturalnej funkcji enzymu Cas i połączenia domeny regulacyjnej z enzymem Cas. System CRISPR-Cas korzysta z wysokiej specyficzności między sgRNA a docelową sekwencją DNA oraz prostoty projektowania nowych sgRNA; jednakże system CRISPR-Cas wymaga sekwencji PAM bezpośrednio przed docelowym miejscem DNA, a duży rozmiar białka Cas utrudnia dostarczanie do komórki.
Opowieści
Efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE) to struktury peptydowe złożone z powtarzających się segmentów o długości 34 aminokwasów, tworzących peptyd o całkowitej długości od 340 do 510 aminokwasów. Każdy powtarzający się segment fałduje się w dwie helisy alfa, a aminokwasy w pozycjach reszt 12 i 13 w powtarzającym się segmencie określają sekwencję wiążącą DNA. Peptyd TALE ma wysoką specyficzność względem docelowego DNA, zapobiegając wtórnym skutkom ubocznym, ale ta wysoka specyficzność zapobiega wiązaniu ATF z wieloma miejscami i wymaga innego ATF dla każdego pożądanego efektu.
Palce cynkowe
Palce cynkowe są naturalnie obfite, biorą udział w wielu procesach regulacyjnych i są powszechnymi eukariotycznymi czynnikami transkrypcyjnymi. Palce cynkowe Cis2/His2 zostały dokładnie zbadane, składają się z 30 aminokwasów, mogą wiązać się z sekwencjami niepalindromowymi i zawierają od 3 do 4 krytycznych aminokwasów w pozycjach 1, 3 i 6 helisy alfa, które oznaczają komplementarne wiązanie sekwencja. Ponieważ palce cynkowe mają tylko 30 aminokwasów, są łatwiejsze do dostarczenia, a wiele palców cynkowych można połączyć razem, aby celować w większe sekwencje DNA za pomocą jednego ATF; jednak połączenie ze sobą więcej niż trzech palców cynkowych zmniejsza specyficzność każdego palca cynkowego i zwiększa kierowanie poza witrynę.
Aplikacje ATF
Przeprogramowanie stanu komórki
Kierowanie różnicowaniem komórek i przeprogramowywanie losów komórek tradycyjnie osiąga się za pomocą mieszanki czynników transkrypcyjnych. Dziedzina ta zyskała duże zainteresowanie, gdy odkryto, że cztery czynniki transkrypcyjne Oct4/Sox2/cMyc/Klf4 przeprogramowują komórki ze stanu zróżnicowanego do indukowanego stanu pluripotencjalnych komórek macierzystych , podobnego do embrionalnych komórek macierzystych. Wiele ATF składających się z trzech połączonych ze sobą białek palca cynkowego może aktywować geny, które ostatecznie prowadzą do produkcji czynnika transkrypcyjnego Oct4 w komórce, powodując przeprogramowanie komórki do indukowanego stanu pluripotencjalnego bez dodawania zewnętrznych czynników transkrypcyjnych Oct4. Zmiana stanu komórki pokazuje, że ATF mogą zastąpić tradycyjne czynniki transkrypcyjne w przeprogramowaniu komórki.
Syndrom Angelmana
Zespół Angelmana jest neurologicznym zaburzeniem rozwoju spowodowanym dezaktywacją matczynego genu UBE3A. Dwie potencjalne strategie leczenia z wykorzystaniem ATF to zwiększenie ekspresji matczynego genu UBE3A lub obniżenie ekspresji genu UBE3A-AS, genu, który powoduje represję ojcowskiego genu UBE3A. Palec cynkowy ATF TAT-S1 działa jako silny represor wobec genu UBE3A-AS, a podawany myszom powodował wzrost Ube3a w mózgu.
Rak
Nieprawidłowa ekspresja genów jest regularnie związana z rakiem i niekontrolowanym wzrostem guza, co czyni ATF obiecującym środkiem terapeutycznym w leczeniu raka. Łącząc ze sobą 6 palców cynkowych w ATF, ATF wiąże się tylko z sekwencją 18 par zasad zawierającą mniejsze podsekwencje komplementarne do każdego palca cynkowego w ATF, więc ATF jest bardziej specyficzny niż jeden palec cynkowy, który celuje tylko w określone 3 do 4 sekwencja par zasad. ATF połączone z domeną regulatorową represora KRAB zmniejszają lekooporność komórek nowotworowych na chemioterapię, a ATF połączone z domenami aktywatora mogą zwiększać ekspresję genu Bax, powodując apoptozę komórek; jednak te terapie pozostają na wczesnym etapie z powodu nieodpowiednich metod dostarczania.