Test biologiczny Microtox
Microtox to system testowania in vitro , który wykorzystuje bakterie bioluminescencyjne ( Allivibrio fischeri , wcześniej znane jako Vibrio fischeri ) do wykrywania substancji toksycznych w różnych podłożach, takich jak woda, powietrze, gleba i osady . Allivibrio fischeri to niepatogenne, morskie bakterie , które świecą jako naturalna część ich metabolizmu . W przypadku wystawienia na działanie substancji toksycznej proces oddychania bakterii zostaje zakłócony, co zmniejsza moc światła. Allivbrio fischeri wykazały wysoką czułość w szerokim zakresie substancji toksycznych. Reakcję na toksyczność obserwuje się jako zmianę luminescencji, która jest produktem ubocznym oddychania komórkowego . Zmianę tę można wykorzystać do obliczenia procentowego zahamowania Allivibrio fischeri , które bezpośrednio koreluje z toksycznością.
Tło
Microtox został opracowany przez Azur Environmental (wcześniej Microbics Corporation) w 1979 roku jako opłacalna alternatywa dla dostępnych wówczas testów toksyczności. Przed wprowadzeniem Microtox większość testów toksyczności dostępnych dla wody koncentrowała się w szczególności na rybach i rozwielitkach. Od samego początku Microtox stał się standardową metodą badania toksyczności wody oraz innych substratów, takich jak gleby i osady.
W ostatnich latach technologia i nazwa Microtox przechodziły przez różnych właścicieli. W 2011 roku Microtox i powiązane technologie zostały przejęte przez Modern Water od Strategic Diagnostics Incorporated (SDIX) za około 4,5 miliona dolarów. Przed SDIX Microtox był własnością jego oryginalnych twórców Azur Environmental.
Microtox wykorzystuje bakterie bioluminescencyjne ( Allivibrio fischeri ) do określenia toksyczności konkretnej substancji i/lub substratu. Podczas metabolizmu komórkowego bakterie te naturalnie emitują światło w ramach oddychania komórkowego , które można zmierzyć jako luminescencję. Po wystawieniu na działanie substancji toksycznych można zaobserwować spadek luminescencji, a procentową zmianę luminescencji można bezpośrednio skorelować z toksycznością. Specjalnie wybrano Allivibrio fischeri , ponieważ bakterie te można było konserwować przez liofilizację aby wydłużyć okres przydatności do spożycia i użytkowania. Przy użyciu tej technologii można przeprowadzić zarówno badanie toksyczności ostrej na fazie stałej (gleby i osady), jak i na wodzie (opisane poniżej).
Materiały
Analizatory
Microtox Model 500 to fotometr laboratoryjny do pomiaru ostrej toksyczności . Analizator ten jest kontrolowanym temperaturowo, samokalibrującym biosensorowym systemem pomiarowym, który wykorzystuje bioluminescencję Allivibrio fischeri do określenia toksyczności zanieczyszczonej wody lub elutriatów zanieczyszczonej gleby i osadów.
Microtox Continuous Toxicity Monitor (CTM) to specyficzny dla danego miejsca analizator Microtox, który w sposób ciągły mierzy toksyczność źródła wody i natychmiast dostarcza wyniki. Ten w pełni automatyczny analizator ma szeroki zakres wykrywania, który może zidentyfikować kilka tysięcy zanieczyszczeń jednocześnie, niezależnie od wiedzy o źródle zanieczyszczenia. To urządzenie może działać nieprzerwanie do 4 tygodni i jest łatwe w obsłudze i konserwacji.
DeltaTox II to przenośne urządzenie, którego można używać do przeprowadzania testów toksyczności ostrej i trifosforanu adenozyny (ATP). To urządzenie, znane również jako przenośna wersja Microtox Model 500, zapewnia proste testy, wykorzystuje małe rozmiary próbek i jest ekonomicznym podejściem do analizy próbek wody. Ten czuły i szybki analizator jest w stanie wykryć mikrobiologiczne , a także ponad 2700 różnych substancji chemicznych.
Odczynniki i roztwory
Microtox Model 500 i Microtox FX
Okres przechowywania Acute Reagent wynosi dwa lata, a roztworów trzy lata, jeśli są prawidłowo przechowywane.
Microtox Acute Reagent to liofilizowana kultura Allivibrio fischeri , którą rekonstytuuje się przed badaniem. Zaleca się użycie odczynnika w ciągu trzech godzin od rekonstytucji. Czułość odczynnika może ulec zmianie po upływie zalecanego czasu.
Microtox Osmotic Adjustment Solution (MOAS) to nietoksyczny roztwór składający się z 22% chlorku sodu ( NaCl ) i ultra czystej wody. Roztwór ten dodaje się do próbki w celu doprowadzenia ciśnienia osmotycznego do około 2% NaCl .
Roztwór do rekonstytucji składa się ze specjalnie przygotowanej, nietoksycznej ultraczystej wody.
Diluent to nietoksyczny roztwór składający się z 2% NaCl w ultra czystej wodzie. Roztwór ten służy do rozcieńczania próbki i odczynnika , a także zapewnia ochronę osmotyczną wymaganą przez Allivibrio fischeri .
Metody
Przygotowanie próbek
Microtox może być stosowany do różnych matryc, w tym do wody pitnej , ścieków deszczowych , ścieków , zrzutów przemysłowych, gleb i osadów. Większość próbek nie wymaga specjalnego przygotowania przed badaniem poza dostosowaniem zasolenia do 2%. Jednak próbki, które mają określone cechy, takie jak wysoki zmętnienia , mogą wymagać specjalnego przygotowania. Jeśli próbki wymagają zasolenia w celu obniżenia zasolenia , można to osiągnąć, dodając odpowiednią ilość roztworu Microtox Osmotic Adjusting Solution w celu rozcieńczenia próbki. Na przykład dodanie 0,1 ml MOAS do 1 ml próbki spowodowałoby rozcieńczenie 90,9% pierwotnego stężenia. Jeśli wymagane jest większe zasolenie , można to osiągnąć poprzez rozpuszczenie stałego chlorku sodu w próbce, aby uzyskać końcowe zasolenie 2% w celu ochrony Allivibrio fischeri . Bardzo mętne próbki zawierające cząstki stałe będą musiały zostać uregulowane przed przeprowadzeniem testu. Cząstki stałe w próbce mogą zakłócać bioluminescencję poprzez pochłanianie światła i dawać mylące wyniki testu. Zakłócenia luminescencji mogą również wystąpić w przypadku próbek o silnym zabarwieniu (szczególnie czerwonym, brązowym lub czarnym). Może być konieczne odwirowanie próbek w celu uzyskania odpowiedniej klarowności do badania. Jeśli próbki zawierają chlor , może to zmienić toksyczność dla Allivibrio fischeri , a także dać mylące wyniki. Próbki można odchlorować za pomocą tiosiarczanu sodu i wody dejonizowanej , który nie wpływa na wyniki testu. W idealnej sytuacji pH próbek nie powinno być modyfikowane, ponieważ preferowane jest badanie każdej próbki przy pierwotnym poziomie pH . Jeśli jednak konieczne jest dostosowanie pH , należy to zrobić, dodając do próbki roztwór wodorotlenku sodu lub kwas solny .
W przeciwieństwie do próbek wody, próbki gleby i osadów nie są jednorodne. W rezultacie trudno jest uzyskać reprezentatywne próbki z takich matryc. Substancje toksyczne prawdopodobnie wiążą się z cząstkami stałymi, a stopień wiązania materiałów toksycznych zależy od składu cząstek. Na przykład mniejsze cząstki, takie jak glina, mają tendencję do ścisłego wiązania się z chemikaliami, działając jak żywice jonowymienne . Testy mikrotoksyczne dla osadu i gleby różnią się sposobem przygotowania matrycy do kontaktu z Allivibrio fischeri . Aby uzyskać reprezentatywną próbkę gleby lub osadu, konieczne jest wykonanie testu elutriatu. Elutriaty osadów można przygotować poprzez ekstrakcję wodą destylowaną, wodą solankową lub rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak chlorek metylenu lub heksan . Aby przeprowadzić test elutriatu, próbkę gleby miesza się przez pewien czas z ekstrahentem, a następnie pozostawia do osadzenia i pobiera próbkę z ekstraktu. Jeśli w pobranej próbce znajdują się cząstki stałe, konieczne może być odwirowanie próbki dla optymalnej przejrzystości. Dodatkowo wodę porową osadów można zbierać przez wirowanie i badać bez ekstrakcji.
Procedury
Istnieje pięć głównych testów Microtox, w tym test podstawowy, test 100%, test fazy stałej, test porównawczy i test hamowania. Z tych pięciu testów trzy są wykorzystywane do badania osadów i gleby, w tym test podstawowy, test 100% i test fazy stałej. We wszystkich tych wersjach stosuje się tę samą ogólną metodę odtwarzania odczynnika Allivibrio fischeri w roztworze do rekonstytucji. Korekty są dokonywane dla zasolenia i cząstek stałych, następnie bakterie są wystawiane na działanie roztworu próbki w zależności od metod konkretnego testu. Strumień świetlny bakterii mierzy się za pomocą a fotometr po 5 i 15 minutach od ekspozycji bakterii na próbki. Zmierzone światło bezpośrednio koreluje z toksycznością próbki, dając dane, które pozwalają na obliczenie EC50 lub IC50s lub innych wartości ECxx i ICxx.
Podstawowy test toksyczności ostrej to procedura, która mierzy względną toksyczność ostrą próbki. Ten test jest najlepszym protokołem do badania próbek o nieznanej toksyczności, wysokim poziomie toksyczności lub gdy wyniki testu mają zapewnić najwyższą pewność i precyzję. Ten test składa się z dwóch kontroli i ośmiu rozcieńczeń próbek w dwóch powtórzeniach.
Acute Toxicity 100% Test to procedura, która bada próbkę przy 100% stężeniu próbki iw rezultacie obejmuje dodanie roztworu odczynnika bezpośrednio do próbki. Ten test jest stosowany do próbek, które mają mieć niski poziom toksyczności i jest ogólnie używany jako narzędzie do badań środowiskowych. W porównaniu z testem podstawowym jest bardziej czuły na technikę operatora, przez co może być mniej precyzyjny.
Test ostrej toksyczności w fazie stałej to procedura, która umożliwia organizmowi testowemu bezpośredni kontakt z próbką stałą w postaci cząstek stałych w zawiesinie wodnej. Zwykle test ten dostarcza wyników wskazujących na równą lub wyższą toksyczność w porównaniu z testami eluatu lub wody porowej dla tej samej próbki. Wynika to z równej lub zwiększonej biodostępności wynikającej z bezpośredniego kontaktu. Ten test podlega kilku źródłom interferencji luminescencji, w tym utracie bakterii w wyniku efektów innych niż toksyczność, takich jak filtracja próbki; pochłanianie światła ze względu na kolor; i rozpraszanie światła z powodu zmętnienia . Korekty można dokonać, badając próbkę o podobnym składzie cząstek, o której wiadomo, że nie jest toksyczna. Ten test składa się z dwóch kontroli i 13 rozcieńczeń próbek w dwóch powtórzeniach. Test fazy stałej eksponuje bakterie w sposób, który nie zawsze jest możliwy w przypadku wody porowej i elutriatu.
Testy porównania i hamowania ostrej toksyczności to najlepsze procedury do badania próbek o niskim poziomie toksyczności, gdy nie można określić ECxx za pomocą testu podstawowego. Protokoły te są zalecane do testowania ścieków z oczyszczalni ścieków , wód opadowych , wody pitnej , wody porowej i eluatu. Testy te wykorzystują wiele powtórzeń próbki w jednym stężeniu. Podobnie jak w przypadku testu podstawowego, protokół testu porównawczego wykorzystuje odczyty światła w czasie zerowym używane do korygowania odczytów poziomu światła w czasie. Procedura Testu Zahamowania nie wykorzystuje odczytów światła w czasie zerowym i dlatego nie może używać współczynnika korekcji dla odczytów poziomu światła w czasie. Oba te testy składają się z pięciu kontroli i pięciu powtórzeń próbki przy jednym stężeniu.
Oprogramowanie Microtox Omni
Oprogramowanie Microtox Omni zostało opracowane przez firmę Azur Environmental i umożliwia użytkownikom analizatora Microtox Model 500 przeprowadzanie testów, wizualizację danych, obliczanie statystyk i generowanie raportów. Ten program zawiera zestaw szablonów dla wszystkich powszechnie używanych testów toksyczności i umożliwia modyfikację lub dodanie do dostarczonych szablonów. Modyfikacja tych szablonów umożliwia tworzenie nowych formatów testów, które nie były oryginalnie dołączone do oprogramowania. Szablony testowe zawarte w tym oprogramowaniu definiują wszystkie parametry dla określonej metody testowej. Ten program oblicza najskuteczniejszy sposób ustawienia żądanego testu w analizatorze Model 500. Do Microsoft Omni dołączony jest także opiekun testów, który zawiera wymienione instrukcje dotyczące konfigurowania i uruchamiania interesującego nas testu. To oprogramowanie umożliwia użytkownikom ładowanie plików z poprzednich wersji oprogramowania Microtox DOS, a także daje użytkownikom możliwość zapisywania nowych danych w tym oryginalnym formacie. A baza danych , która umożliwia użytkownikom dostęp do danych pochodzących od wielu innych użytkowników i witryn testowych, umożliwiając porównywanie danych i zmian trendów w czasie. Microtox Omni może być używany z dowolną liczbą baz danych .
Aplikacja
Microtox ma wiele zastosowań środowiskowych i przemysłowych. Typowe zastosowania to badanie toksyczności wody morskiej i słodkiej, a także osadów na obecność pestycydów i innych nieorganicznych i organicznych substancji chemicznych.
Woda pitna: Microtox jest używany do testowania źródeł wody pitnej w wielu obszarach, gdzie możliwe jest przypadkowe lub celowe zanieczyszczenie. Toksyczne zanieczyszczenia wody pitnej są wskazywane przez zmianę koloru lub intensywności światła lub przez zmianę tempa zużycia tlenu.
Jeziora i rzeki: Microtox służy do testowania toksyczności osadów jeziornych i rzecznych zanieczyszczonych metalami lub niespecyficznymi zanieczyszczeniami. Test w fazie stałej jest stosowany do osadów, podczas gdy test podstawowy lub test 100% jest używany do wody porowej.
Badanie osadów: Microtox służy do testowania i oceny toksyczności różnych osadów morskich i słodkowodnych zanieczyszczonych metalami i substancjami organicznymi. Wodne ekstrakty zanieczyszczonych gleb, płuczek wiertniczych i szlamów. Dane mikrotoksyczne mogą być wykorzystywane do ustalania progu widocznych skutków (AET), standardów jakości osadów i wykorzystywane do NPDES , a także poziomów oczyszczania Superfund .
Przemysłowe: Ten test biologiczny jest używany do oceny toksyczności złożonych źródeł ścieków przemysłowych. Jest to opłacalny sposób monitorowania i testowania dużej liczby próbek. Microtox może być również stosowany jako system wczesnego ostrzegania (EWS) i pomaga w wykrywaniu obecności materiałów toksycznych, a także w przewidywaniu wyników innych testów biologicznych i testów.
Microtox został również zastosowany do testów na zwierzętach jako alternatywa in vitro .
Znaczenie ekologiczne
Liczne badania i opublikowane dane porównujące wyniki Microtox z wartościami toksyczności dla ryb, skorupiaków i alg wykazały dodatnią korelację. Jednak inni zwrócili uwagę, że wpływ jasności na przeżycie organizmów jest nieznany. Wyrażono również obawy dotyczące stosowania ekstraktów z osadów, a nie samych osadów. Możliwe, że badane będą tylko zanieczyszczenia rozpuszczalne w wodzie, a zatem mogą nie być reprezentatywne dla pełnego zakresu zanieczyszczeń obecnych w osadzie. Ekstrakty mogą również usuwać zanieczyszczenia, które nie są biodostępne. Może to prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania zanieczyszczeń i ich skutków biologicznych.