Test chemotaksji

Proces chemotaksji można wykazać za pomocą testu z rurką kapilarną (pokazany powyżej). Ruchliwe prokarionty potrafią wyczuwać substancje chemiczne w swoim środowisku i odpowiednio zmieniać swoją ruchliwość. Gdy nie ma żadnych substancji chemicznych, ruch jest całkowicie przypadkowy. Gdy obecna jest substancja chemiczna odstraszająca lub wabiąca, zmienia się ruchliwość; przebiegi stają się dłuższe, a wstrząsy stają się rzadsze, dzięki czemu można osiągnąć ruch sieci w kierunku lub od substancji chemicznej. Ruch sieci można zobaczyć w zlewce, gdzie bakterie gromadzą się wokół atraktantu i z dala od repelentu. Zlewka użyta na tej ilustracji pochodzi z Wikimedia Commons – „ Laboratory Glassware – Beaker ” autorstwa Amanda44.

Testy chemotaksji to eksperymentalne narzędzia do oceny zdolności chemotaktycznej komórek prokariotycznych lub eukariotycznych . Opracowano wiele różnych technik. Niektóre techniki są jakościowe – pozwalają badaczowi w przybliżeniu określić powinowactwo chemotaktyczne komórki do analitu – podczas gdy inne są ilościowe , co pozwala na precyzyjny pomiar tego powinowactwa.

Kontrola jakości

Ogólnie rzecz biorąc, najważniejszym wymogiem jest skalibrowanie czasu inkubacji testu zarówno dla komórki modelowej, jak i ocenianego ligandu. Zbyt krótki czas inkubacji skutkuje brakiem komórek w próbce, podczas gdy zbyt długi czas zaburza gradienty stężeń i mierzy więcej odpowiedzi chemokinetycznych niż chemotaktycznych .

Najczęściej stosowane techniki są podzielone na dwie główne grupy:

Techniki płytek agarowych

Testy chemotaksji z płytkami agarowymi

Ten sposób oceny dotyczy warstw półstałych zawierających agar-agar lub żelatynę wykonanych przed doświadczeniem. W warstwie wycina się małe studzienki i wypełnia komórkami oraz substancją badaną. Komórki mogą migrować w kierunku gradientu chemicznego w warstwie półstałej lub pod warstwą. Niektóre odmiany tej techniki dotyczą również studni i równoległych kanałów połączonych przecięciem na początku eksperymentu (technika PP). Radialny układ techniki PP (3 lub więcej kanałów) zapewnia możliwość porównania aktywności chemotaktycznej różnych populacji komórek lub preferencji badania między ligandami.

Liczenie komórek: pozytywne komórki reagujące można policzyć od przodu migrujących komórek, po barwieniu lub w warunkach natywnych pod mikroskopem świetlnym.

Techniki dwukomorowe

Testy komorowe chemotaksji

Komora Boydena

Komory izolowane przez filtry są odpowiednimi narzędziami do dokładnego określania zachowania chemotaktycznego. Pionierski typ tych komór został skonstruowany przez Boydena. Ruchome komórki umieszcza się w górnej komorze, a płyn zawierający badaną substancję wlewa się do dolnej. Wielkość badanych ruchomych komórek określa wielkość porów filtra; istotne jest, aby wybrać średnicę, która umożliwia aktywną transmigrację. W przypadku modelowania in vivo , kilka protokołów preferuje pokrycie filtra cząsteczkami macierzy pozakomórkowej ( kolagen , elastyna itp.) Wydajność pomiarów została zwiększona dzięki opracowaniu komór wielodołkowych (np. NeuroProbe), w których ocenia się 24, 96, 384 próbki równoległy. Zaletą tego wariantu jest to, że kilka podobieństw jest testowanych w identycznych warunkach.

Komory mostowe

W innym ustawieniu komory są połączone poziomo obok siebie (komora Zigmonda) lub jako koncentryczne pierścienie na szkiełku (komora Dunna) Na wąskim mostku łączącym komory powstaje gradient stężenia, a liczba migrujących komórek jest również liczona na powierzchni mostu za pomocą mikroskopu świetlnego. W niektórych przypadkach mostek między dwiema komorami jest wypełniony agarem i komórki muszą „ ślizgać się ” w tej półstałej warstwie.

Techniki kapilarne

Niektóre techniki kapilarne zapewniają również układ przypominający komorę, jednak nie ma filtra między komórkami a badaną substancją. Wyniki ilościowe uzyskuje się za pomocą wielostudzienkowej sondy tej sondy przy użyciu 4-8-12-kanałowych pipet. Dużą zaletą tego testu jest dokładność pipety oraz zwiększona liczba równolegle przebiegających próbek.

Zliczanie komórek: pozytywne komórki odpowiadające są liczone z dolnej komory (długi czas inkubacji) lub z filtra (krótki czas inkubacji). Do wykrywania komórek stosuje się ogólne techniki barwienia (np. błękitem trypanu ) lub specjalne sondy (np. wykrywanie dehydrogenazy mt w teście MTT). Stosowane są również komórki znakowane (np. fluorochromami ), w niektórych testach komórki są znakowane podczas transmigracji przez filtr.

Inne techniki

Inne techniki oznaczania chemotaksji

Oprócz wyżej wymienionych dwóch najczęściej stosowanych rodzin technik, opracowano szeroki zakres protokołów do pomiaru aktywności chemotaktycznej. Niektóre z nich mają charakter wyłącznie jakościowy, jak np. testy agregacyjne, w których małe kawałki agaru lub filtry umieszcza się na szkiełku i mierzy nagromadzenie komórek wokół.

W innej technice półilościowej komórki pokrywa się substancją badaną iw czasie inkubacji rejestruje się zmiany opalescencji kompartmentu pierwotnie wolnego od komórek.

Trzecią często stosowaną techniką jakościową jest labirynt T i jego adaptacje do mikropłytek. W oryginalnej wersji pojemnik wywiercony w kołku jest wypełniony komórkami. Następnie kołek zostaje przekręcony i komórki stykają się z dwoma innymi pojemnikami wypełnionymi różnymi substancjami. Inkubację zatrzymuje się przez ponowne ustawienie kołka i zlicza się liczbę komórek z pojemników.

Również ostatnio ^{[ kiedy? ]} urządzenia mikroprzepływowe są coraz częściej używane do ilościowego i precyzyjnego testowania chemotaksji.

Linki zewnętrzne