Test gojenia się rany
Test gojenia ran to technika laboratoryjna stosowana do badania migracji komórek i interakcji między komórkami . Nazywa się to również testem zarysowania , ponieważ wykonuje się go poprzez wykonanie zarysowania na monowarstwie komórek i przechwytywanie obrazów w regularnych odstępach czasu za pomocą mikroskopu poklatkowego.
Jest to w szczególności podejście do migracji komórek 2D w celu półilościowego pomiaru migracji komórek arkusza komórek. To zadrapanie można wykonać różnymi metodami, takimi jak uszkodzenia mechaniczne, termiczne lub chemiczne. Celem tego zadrapania jest utworzenie obszaru wolnego od komórek w nadziei na skłonienie komórek do migracji i zamknięcia luki. Test zarysowania jest idealny tylko dla typów komórek, które migrują jako zbiorcze warstwy nabłonka i nie jest przydatny dla komórek nieprzylegających. W szczególności ten test nie jest idealny do chemotaksji .
Zalety i wady
Ta technika laboratoryjna ma różne zalety. Po pierwsze, testy te są stosunkowo tanie, stosunkowo proste i umożliwiają pomiary w czasie rzeczywistym. Ponadto warunki testowania można łatwo dostosować do różnych celów eksperymentalnych. Takie podejście pozwala również na silną kierunkową reakcję migracyjną, co upraszcza kwantyfikację danych.
Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że mogą występować niespójności z głębokością i rozmiarem rysy. Kiedy rysowanie jest wykonywane ręcznie, jest podatne na „postrzępione” krawędzie, co utrudnia analizę danych. Uszkodzenie może również fizycznie uszkodzić komórki przylegające do rany i utworzyć obszary o niedokładnym rozmiarze. To ograniczenie powoli staje się coraz mniejszym problemem w przypadku zautomatyzowanych technologii. Testy wykrywania impedancji komórek elektrycznych wykorzystują je do zapobiegania uszkodzeniom komórek w podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wystąpić w przypadku ręcznego drapania. Ponadto Woundmaker wykonuje szybkie i jednorodne rany w różnych opcjach numerowanych płytek dołkowych (96 lub 384) i pozwala na wysokowydajne badania przesiewowe, co jest główną zaletą w przypadku różnych badań medycznych.
Pomimo nowej technologii, która zwiększa dokładność i skuteczność tego testu, nadal istnieją czynniki zakłócające, które mogą wypaczyć wyniki testu, takie jak „stłoczenie” komórek, efekty adhezji komórki/komórki i efekty matrycy. Dodatkowo wciąż wspomina się o problemie gromadzenia się komórek na krawędzi rysy, co powoduje nierównomierne zagęszczenie komórek.
Niektórzy sceptycy uważają, że rysa stworzona do testu nie jest bardzo dokładnym odzwierciedleniem rzeczywistej rany. Jest to bardzo prawdopodobne, ponieważ prawdziwe rany są z natury bardziej złożone, ale ten test pozwala na zbiorowe ruchy komórek w określonych warunkach eksperymentalnych, aby zapewnić pewien wgląd.
Pomimo tego, że jest opisana jako prosta, technika ta była krytykowana z powodu niespójności w jej stosowaniu z jednego eksperymentu do drugiego.
Standardowy protokół laboratoryjny
Przedstawiono standardowe podejście do przeprowadzenia tego testu bez zaawansowanej technologii:
- Umieścić wybrane komórki w pożywce hodowlanej w szalce do obrazowania żywych komórek lub szkiełku komorowym. Ważne jest, aby upewnić się, że utworzona została pojedyncza warstwa, ponieważ grudki mogą dawać niedokładne wyniki ze względu na nierówną gęstość komórek. Konieczne jest miareczkowanie komórek w celu określenia optymalnej gęstości wysiania.
- Kiedy konfluencja komórek jest idealna, końcówką pipety zadrapać ranę przez cały środek studzienki. Jak wspomniano wcześniej, w tym teście pojawia się potencjalna niespójność. Jeśli rysa jest wykonywana ręcznie, ważne jest, aby rana była widoczna z obu stron pola widzenia i miała szerokość około 0,5 mm.
- Komórki można następnie umieścić na mikroskopie z obiektywem względnym 20x.
- Rozpocznij mikroskopię poklatkową i dostosuj parametry zgodnie z różnorodnością badanych komórek. Szybko rosnące komórki mogą wymagać krótszych odstępów czasu, aby uzyskać dokładniejszą prędkość komórki.
Aplikacje
- Ilościowa/jakościowa analiza zbiorowej migracji komórek w zmiennych warunkach doświadczalnych.
- Analiza interakcji komórka-macierz i komórka-komórka pod kątem migracji komórek.
- Ekrany o dużej przepustowości dla:
- Geny migracji komórek rakowych
- Małe cząsteczki
- Odkrycie narkotyków
Metryki do ilościowego określenia migracji komórek
Szybkość migracji komórek:
- gdzie
- R M = Szybkość migracji komórek
- W ja = Początkowa szerokość rany
- W f = ostateczna szerokość rany
- t = czas trwania migracji
Względna gęstość rany:
![{\displaystyle \%RWD(t)=[(w_{t}-w_{0})/(c_{t}-w_{0})]*100}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a8a2a74df892bd2f71108118a3159fead378cdb2)
- gdzie
- w t = Gęstość obszaru rany w czasie t
- c t = Gęstość obszaru komórek w czasie t
Powyższe są podstawowymi wskaźnikami, które można zmierzyć za pomocą tego testu. Jednak nadal podejmowane są wysiłki w celu poprawy interpretacji tego testu. Oceniono trzy różne pomiary: średnią szybkości bezpośredniej, średnią szybkości regresji i średnią szybkość regresji odległości. Współczynnik średniej szybkości bezpośredniej i współczynnik regresji średniej odległości były bardziej odporne na wartości odstające, podczas gdy średni wskaźnik regresji był bardziej wrażliwy na wartości odstające.
Migracja komórek
Test zarysowania jest doskonałym narzędziem do badania migracji komórek , ponieważ mechanizm ten jest zaangażowany w wiele różnych aspektów fizjologicznych. Migracja komórek odgrywa ogromną rolę w ponownym nabłonku skóry, dlatego badanie migracji komórek może zapewnić postęp w zrozumieniu niegojących się ran. Migracja komórek ma również fundamentalne znaczenie w procesach rozwojowych, takich jak gastrulacja i organogeneza. Migracja komórek bierze również udział w odpowiedziach immunologicznych i przerzutach raka.
Biologia raka
Dzięki postępowi technologicznemu test ten staje się bardzo korzystny, zwłaszcza w dziedzinie biologii raka. Przeprowadzono badanie, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką klaudyna-7, rodzina białek połączeń ścisłych, odgrywa w migracji komórek w typie ludzkich komórek raka płuc. Ze względu na wolniejsze tempo migracji komórek knockdown claudin-7, potwierdza to pogląd, że to białko jest ważne w migracji komórek i zdolności komórki do przerzutów. Komórki przechodzą migrację warstwy z powodu wielu sygnałów i mechanizmów podczas próby zamknięcia rany, co uważa się za podobne do podstawowych mechanizmów zaangażowanych w przerzuty.
Alternatywy dla testu gojenia się ran
Używając urządzeń do obrazowania żywych komórek bez znaczników, opartych na ilościowym obrazowaniu fazowym , wykazano, że ruchliwość komórek jest silnie skorelowana z gojeniem się ran i wynikami testu transwell. Zaletą tego w pełni zautomatyzowanego podejścia jest to, że ilościowa ocena ruchliwości komórek nie wymaga specjalnego przygotowania próbki, co pozwala na jednoczesne ilościowe określenie proliferacji komórek .