Tomografia elektronowa
Tomografia elektronowa (ET) to technika tomografii służąca do uzyskiwania szczegółowych struktur 3D próbek subkomórkowych , makrocząsteczkowych lub materiałów. Tomografia elektronowa jest rozszerzeniem tradycyjnej transmisyjnej mikroskopii elektronowej i wykorzystuje transmisyjny mikroskop elektronowy do zbierania danych. W tym procesie wiązka elektronów jest przepuszczana przez próbkę przy zwiększających się stopniach obrotu wokół środka próbki docelowej. Informacje te są gromadzone i wykorzystywane do tworzenia trójwymiarowego obrazu celu. W zastosowaniach biologicznych typowa rozdzielczość systemów ET mieści się w zakresie 5–20 nm , co jest odpowiednie do badania supramolekularnych struktur wielobiałkowych, chociaż nie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur pojedynczego białka lub polipeptydu . Ostatnio wykazano rozdzielczość atomową w rekonstrukcjach tomografii elektronowej 3D.
Tomografia BF-TEM i ADF-STEM
W dziedzinie biologii transmisyjna mikroskopia elektronowa w jasnym polu (BF-TEM) i TEM o wysokiej rozdzielczości ( HRTEM ) to podstawowe metody obrazowania do akwizycji serii pochyleń tomografii. Istnieją jednak dwa problemy związane z BF-TEM i HRTEM. Po pierwsze, uzyskanie interpretowalnego tomogramu 3D wymaga, aby intensywność wyświetlanego obrazu zmieniała się monotonicznie wraz z grubością materiału. Warunek ten jest trudny do zagwarantowania w BF / HRTEM, gdzie intensywność obrazu jest zdominowana przez kontrast fazowy z możliwością wielokrotnego odwrócenia kontrastu wraz z grubością, co utrudnia odróżnienie pustych przestrzeni od wtrąceń o dużej gęstości. Po drugie, funkcja przenoszenia kontrastu BF-TEM jest zasadniczo filtrem górnoprzepustowym — informacje o niskich częstotliwościach przestrzennych są znacznie tłumione — co skutkuje wyolbrzymieniem ostrych cech. Jednak technika pierścieniowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej w ciemnym polu (ADF-STEM), która jest zwykle stosowana na próbkach materiałów, skuteczniej tłumi kontrast fazowy i dyfrakcyjny, zapewniając intensywność obrazu, która zmienia się wraz z przewidywaną grubością masy próbek do mikrometrów grubości dla materiałów o niskiej liczbie atomowej . ADF-STEM działa również jako filtr dolnoprzepustowy , eliminując artefakty wzmacniające krawędzie, powszechne w BF/HRTEM. Tak więc, pod warunkiem, że cechy mogą zostać rozwiązane, tomografia ADF-STEM może zapewnić wiarygodną rekonstrukcję próbki leżącej pod spodem, co jest niezwykle ważne dla jej zastosowania w materiałoznawstwie . W przypadku obrazowania 3D rozdzielczość jest tradycyjnie opisana kryterium Crowthera . W 2010 roku za pomocą jednoosiowej tomografii ADF-STEM uzyskano rozdzielczość 3D 0,5 ± 0,1 × 0,5 ± 0,1 × 0,7 ± 0,2 nm.
Atomowa tomografia elektronowa (AET)
Wykazano rozdzielczość na poziomie atomowym w rekonstrukcjach tomografii elektronowej 3D. Osiągnięto rekonstrukcje defektów kryształów, takich jak uskoki układania , granice ziaren , dyslokacje i bliźniacze struktury. Metoda ta ma zastosowanie w naukach fizycznych, gdzie techniki krio-EM nie zawsze mogą być stosowane do lokalizowania współrzędnych poszczególnych atomów w nieuporządkowanych materiałach. Rekonstrukcje AET uzyskuje się przy użyciu kombinacji tomograficznej serii pochyleń ADF-STEM i iteracyjnych algorytmów rekonstrukcji . Obecnie algorytmy, takie jak technika rekonstrukcji algebraicznej w przestrzeni rzeczywistej (ART) i tomografia równorzędnych nachyleń z szybką transformacją Fouriera (EST), są wykorzystywane do rozwiązywania problemów, takich jak szum obrazu, dryf próbki i ograniczone dane. Tomografia ADF-STEM została ostatnio wykorzystana do bezpośredniej wizualizacji struktury atomowej dyslokacji śrubowych w nanocząstkach. AET został również wykorzystany do znalezienia współrzędnych 3D 3769 atomów w igle wolframowej z dokładnością do 19 pm i 20 000 atomów w wielokrotnie bliźniaczej nanocząstce palladu. Połączenie AET ze spektroskopią strat energii elektronów (EELS) umożliwia badanie stanów elektronowych oprócz rekonstrukcji 3D. Wyzwania związane z rozdzielczością na poziomie atomowym z tomografii elektronowej obejmują potrzebę lepszych algorytmów rekonstrukcji i zwiększoną precyzję kąta nachylenia wymaganego do obrazowania defektów w próbkach niekrystalicznych.
Różne metody przechylania
Najpopularniejszymi metodami przechylania są metody przechylania jednoosiowego i dwuosiowego. Geometria większości uchwytów na preparaty i mikroskopów elektronowych zwykle uniemożliwia przechylenie preparatu w pełnym zakresie 180°, co może prowadzić do artefaktów w trójwymiarowej rekonstrukcji celu. Standardowe uchwyty próbek z pojedynczym przechyleniem mają ograniczony obrót do ±80°, co prowadzi do braku klina w rekonstrukcji. Rozwiązaniem jest użycie próbek w kształcie igły, aby umożliwić pełny obrót. osiach artefakty rekonstrukcji są zmniejszone o współczynnik w porównaniu z w jednej osi. Trzeba jednak zrobić dwa razy więcej zdjęć. Inną metodą uzyskiwania serii pochylenia jest tzw. metoda tomografii stożkowej, w której próbkę przechyla się, a następnie obraca o pełny obrót.
