Utrata fluorescencji w fotowybielaniu
Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP) to technika mikroskopii fluorescencyjnej stosowana do badania ruchu cząsteczek wewnątrz komórek i błon. Błona komórkowa jest zwykle znakowana barwnikiem fluorescencyjnym, aby umożliwić obserwację. Określony obszar tej oznaczonej sekcji jest następnie kilkakrotnie wybielany za pomocą wiązki konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego . Po każdym skanowaniu obrazowym następuje ponowne wybielenie. Dzieje się to kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie dostępne fluorofory są wybielone, ponieważ niebielone fluorofory są wymieniane na wybielone fluorofory, powodując ruch przez błonę komórkową. Ilość fluorescencji z tego regionu jest następnie mierzona przez pewien okres czasu w celu określenia wyników fotowybielania na komórce jako całości.
Zestaw doświadczalny
Zanim może nastąpić fotowybielanie, komórki muszą zostać wstrzyknięte białkiem fluorescencyjnym, często białkiem zielonej fluorescencji (GFP) , które umożliwi fluorescencję docelowych białek, a zatem będzie śledzone przez cały proces. Następnie należy zdefiniować interesujący nas region. Ten początkowy obszar zainteresowania zwykle zawiera całą komórkę lub kilka komórek. W FLIP fotowybielanie zachodzi tuż poza obszarem zainteresowania; dlatego należy również zdefiniować region fotowybielania. Należy również określić trzeci region, region, w którym odbędzie się pomiar. Przed fotowybielaniem należy wykonać szereg wstępnych skanów w celu określenia fluorescencji. Skany te będą służyły jako skany kontrolne, z którymi później zostaną porównane skany fotowybielane. Może wtedy wystąpić fotowybielanie. Pomiędzy każdym impulsem wybielania konieczne jest pozostawienie czasu na odzyskanie materiału fluorescencyjnego. Ważne jest również, aby wykonać kilka skanów obszaru zainteresowania bezpośrednio po każdym impulsie wybielającym w celu dalszych badań. Zmianę fluorescencji w obszarze zainteresowania można następnie określić ilościowo na jeden z trzech sposobów. Najczęściej wybiera się lokalizację, rozmiar i liczbę interesujących regionów na podstawie oględzin zestawów obrazów. Dwa inne, raczej nowe, ale bardziej niezawodne podejścia polegają albo na wykrywaniu obszarów o różnej ruchliwości sondy na podstawie indywidualnego obrazu, albo na fizycznym modelowaniu utraty fluorescencji przez poruszające się ciała.
Utrata fluorescencji jest definiowana przez frakcję ruchomą lub frakcję fluoroforów zdolnych do powrotu do obszaru fotowybielonego białka znakowanego fluorescencyjnie. Niecałkowita utrata fluorescencji wskazuje, że istnieją fluorofory, które nie poruszają się ani nie przemieszczają się do wybielonego obszaru. Pozwala to na zdefiniowanie frakcji nieruchomej lub frakcji fluoroforów niezdolnych do powrotu do obszaru fotobielonego białek znakowanych fluorescencyjnie. Nieruchomość wskazuje, że istnieją białka, które mogą znajdować się w przedziałach zamkniętych od reszty komórki, zapobiegając wpływowi na nie powtarzającego się fotowybielania.
Aplikacje
Weryfikacja ciągłości organelli błoniastych
Podstawowym zastosowaniem FLIP jest określenie ciągłości organelli błoniastych. Tę ciągłość lub jej brak określa się obserwując wielkość fluorescencji w obszarze zainteresowania. Jeśli następuje całkowita utrata fluorescencji, oznacza to, że organelle są ciągłe. Jeśli jednak występuje niecałkowita utrata fluorescencji, nie ma ciągłości między organellami. Zamiast tego, te organelle są podzielone na przedziały, a zatem zamknięte dla przenoszenia jakichkolwiek fotowybielonych fluoroforów. Ciągłość aparatu Golgiego, retikulum endoplazmatycznego i jądra została zweryfikowana za pomocą FLIP.
Kurs wymiany między jądrem a cytoplazmą
Dwa inne, rzadziej stosowane zastosowania FLIP to określenie, w jaki sposób białka są transportowane z cytoplazmy do jądra, a następnie określenie szybkości, z jaką zachodzi ten transfer. Aby określić, które części są zaangażowane i kiedy są zaangażowane w proces wahadłowy, obserwuje się ciągłe skanowanie. Im szybciej część cytoplazmy zostanie wykorzystana w procesie wahadłowym, tym szybciej dochodzi do całkowitej utraty fluorescencji. Uzyskany obraz tego procesu powinien być całkowicie fotowybieloną cytoplazmą. Jeśli komórka uczestniczy również w eksporcie jądra z jądra do cytoplazmy, fotowybielanie wystąpi również w jądrze.
Na podstawie tego typu danych można również określić kurs wymiany między jądrem a cytoplazmą. W takich przypadkach obszar fotowybielania znajduje się w jądrze. Jeśli ruch wahadłowy nastąpi w szybkim tempie, poziomy fluorescencji w przedziałach jądrowych będą gwałtownie spadać w ramach wykonanych klatek. Jeśli jednak ruch wahadłowy zachodzi powoli, poziomy fluorescencji pozostaną niezmienione lub zmniejszą się tylko nieznacznie.
FLIP kontra FRAP
FLIP jest często używany i jest ściśle powiązany z odzyskiwaniem fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Główna różnica między tymi dwiema technikami mikroskopii polega na tym, że FRAP obejmuje badanie zdolności komórki do regeneracji po pojedynczym zdarzeniu fotowybielania, podczas gdy FLIP obejmuje badanie, w jaki sposób utrata fluorescencji rozprzestrzenia się w komórce po wielu zdarzeniach fotowybielania. Ta różnica w celu prowadzi również do różnicy w obserwowanych częściach komórki. W FRAP obszar, który jest faktycznie fotowybielany, jest obszarem zainteresowania. I odwrotnie, w FLIP region będący przedmiotem zainteresowania znajduje się tuż poza regionem, który jest fotowybielany. Inną ważną różnicą jest to, że w FRAP występuje pojedyncze zdarzenie fotowybielania i okres regeneracji, aby obserwować, jak dobrze fluorofory wracają do wybielonego miejsca. Jednak w FLIP występuje wiele zdarzeń fotowybielania, aby zapobiec powrotowi niebielonych fluoroforów do obszaru wybielenia. Podobnie jak FLIP, FRAP jest używany do badania ciągłości organelli błoniastych. FLIP i FRAP są często używane razem w celu określenia ruchliwości białek znakowanych GFP. FLIP można również wykorzystać do pomiaru transferu molekularnego między regionami komórki, niezależnie od szybkości ruchu. Pozwala to na bardziej wszechstronną analizę transportu białek w komórce. Różni się to od FRAP, które jest przydatne przede wszystkim do określania ruchliwości białek w regionach lokalnych tylko dla fotowybielania.
Potencjalne komplikacje
Istnieje kilka komplikacji związanych zarówno z FLIP, jak i FRAP. Ponieważ obie formy mikroskopii badają żywe komórki, zawsze istnieje możliwość, że komórki się poruszą, powodując fałszywe wyniki. Najlepszym sposobem uniknięcia tego jest użycie algorytmu wyrównania, który zrekompensuje każdy ruch i wyeliminuje dużą część błędu spowodowanego ruchem. W tych eksperymentach kluczowe jest również posiadanie grupy kontrolnej w celu dostosowania wyników i skorygowania krzywej odzyskiwania dla ogólnej utraty fluorescencji. Innym sposobem zminimalizowania błędu jest ograniczenie fotowybielania do jednego regionu lub obszaru. To ograniczenie będzie służyć jako kontrola i ograniczenie utraty fluorescencji spowodowanej fotouszkodzeniami w porównaniu z utratą fluorescencji spowodowaną fotowybielaniem.