VINE-nast

VINE-seq ( V essel I solation and Nuclei Extraction for Sequencing ) to metoda izolowania i molekularnej charakterystyki komórek naczyniowych i okołonaczyniowych mikronaczyń ludzkiego mózgu z rozdzielczością pojedynczych jąder. Technikę tę uzyskuje się poprzez połączenie różnych znanych strategii laboratoryjnych obejmujących mechaniczną dysocjację próbek tkanki mózgowej na pojedyncze komórki, wirowanie w gradiencie gęstości oraz filtracja w celu wyizolowania jąder mikronaczyń, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FAC) populacji komórkowych i kropelkowe sekwencjonowanie pojedynczych jąder RNA (drop-snRNA-seq). W sumie generuje to profil transkryptomiczny pojedynczego jądra różnych typów komórek obecnych w układzie naczyniowym mózgu. Dzięki przetwarzaniu i analizie danych transkryptomicznych pojedynczego jądra można rozróżnić heterogeniczność w obrębie typów komórek i między nimi, aby skonstruować krajobraz molekularny układu naczyniowego ludzkiego mózgu, czego wcześniej nie robiono.

Tło

Główną cechą zdrowia mózgu jest utrzymanie złożonego układu naczyniowego, który działa w celu transportu niezbędnych metabolitów , tlenu, składników odżywczych i odpadów do iz ludzkiego mózgu. Zakłócenie układu naczyniowego może prowadzić do zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera i udar . Układ naczyniowy jest domem dla heterogennej grupy typów komórek, w tym między innymi komórek śródbłonka , perycytów , astrocytów i leukocytów . Chociaż na przestrzeni lat podjęto wiele prób zrozumienia różnorodności komórkowej układu naczyniowego, ograniczenia metodologiczne i technologiczne utrudniają nam rozszyfrowanie złożonej istoty mózgu. Dlatego nasze opcje leczenia zaburzeń neurologicznych były nieodpowiednie z powodu naszej niepełnej charakterystyki komórek naczyniowych i okołonaczyniowych w tym złożonym środowisku. Dzięki niedawnym postępom w sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), atlas molekularny układu naczyniowego mózgu u myszy został zdekodowany i powoli odkryto heterogenną naturę typów komórek występujących w ludzkim mózgu. Pomimo tych osiągnięć mysiego może nie w pełni rekapitulować układ naczyniowy mózgu człowieka, co prowadzi do obaw związanych z translacją potencjał. Ponadto wiele wcześniejszych badań skupiających się na sekwencji scRNA ludzkiego mózgu nie charakteryzowało heterogenności komórkowej w układzie naczyniowym. Wprowadzając nowatorską metodę o nazwie VINE-seq, grupa badawcza opracowała metodę izolowania nienaruszonych jąder z mikronaczyń mózgowych. Aby to osiągnąć, musieli sprostać wyzwaniu usunięcia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która otacza mikronaczynia bez uszkadzania jąder. Używając VINE-seq na zamrożonych tkankach mózgowych z hipokampa i kory mózgowej dostarczyli pierwszej charakterystyki różnych typów komórek w układzie naczyniowym ludzkiego mózgu w rozdzielczości pojedynczego jądra.

Ilustracja metodologii VINE-seq

Metodologia

VINE-Seq to nowatorska metoda szczegółowego badania układu naczyniowego ludzkiego mózgu. Wykorzystuje połączenie metod laboratoryjnych z transkryptomiką pojedynczych nukleotydów w celu stworzenia atlasu typów komórek naczyniowych i okołonaczyniowych w mózgu. Poniższe kroki szczegółowo opisują podstawę protokołu VINE-Seq:

  1. Początkowa część protokołu obejmuje metodologię zaadaptowaną z izolacji splenocytów i oczyszczenia próbki. W przypadku VINE-Seq tkanka ludzkiego mózgu jest wstępnie pobierana pośmiertnie. Naukowcy pobrali tkankę mózgową z hipokampu i górnej części kory czołowej .
  2. Próbki tkanek homogenizuje się aż do całkowitego wymieszania i braku widocznej tkanki. Próbki miesza się z 32% roztworem dekstranu w HBSS. Wirowanie przeprowadza się przy 4400 g przez 20 minut w celu rozdzielenia warstw komórkowych z osadem zawierającym skondensowany układ naczyniowy. Pozostałe warstwy mieliny i komórek miąższowych są odsysane bez naruszania osadu.
  3. Peletki ponownie zawiesza się w roztworze dekstranu. Przeprowadza się serię przemyć PBS w celu dalszego odkażenia osadu z resztek komórkowych. Mikronaczynia są odsłaniane, a pozostałe szczątki komórkowe są usuwane.
  4. metodę zaprojektowaną do ekstrakcji mysich splenocytów, aby pomóc wyizolować jądra z pozostałych komórek naczyniowych. Odwirowuje się przy 500 g przez 10 minut w celu oddzielenia komórek naczyniowych od jąder i ponownie zawiesza w roztworze buforu do lizy, inhibitora RNazy i wolnego od EDTA inhibitora proteazy. Jądra są następnie homogenizowane za pomocą szklanych wypychaczy. Próbki ponownie osadza się przez wirowanie .
  5. Pozostałe szczątki komórkowe i produkty uboczne są usuwane przy użyciu przemywania gradientem sacharozy i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Pelety są oczyszczane, aby pomóc uzyskać dane wysokiej jakości.
  6. Dla pozostałych jąder stosuje się cytometrię przepływową. Ta technika służy do określania właściwości fizycznych i chemicznych jąder naczyniowych.
  7. Laboratoryjne przebiegi cytometrii przepływowej przeszacowano w stosunku do oczekiwanych wartości 3,4-krotnie. W odpowiedzi naukowcy wyizolowali i posortowali więcej jąder, aby uzyskać około 10 000 jąder na próbkę. Po sortowaniu przepływowym wymagane jest 10 000 jąder na próbkę do wykonania bibliotek snRNA-seq opartych na kroplach.
  8. Kropelkowe biblioteki snRNA-seq są przygotowywane do sekwencjonowania. Odpowiednie cDNA otrzymuje się po 15 cyklach PCR . Naukowcy z powodzeniem zsekwencjonowali jądra naczyniowe na liniach S4 na NovaSeq 6000.

Aplikacje

Mapowanie mózgu

Dzięki swoim eksperymentom i analizie transkryptomicznej autorzy i twórcy VINE-Seq odkryli, że seria metod była w stanie wyjaśnić transkryptomiczną ekspresję komórek śródbłonka naczyniowego i komórek mięśni gładkich obecnych w organizacji tętniczo-żylnej w zdrowej ludzkiej tkance mózgowej. Ponadto projekt VINE-seq był w stanie uchwycić dwie nowe subpopulacje perycytów zwane perycytami macierzowymi i perycytami transportowymi, które mogą być zaangażowane odpowiednio w modulację ECM i transport przezbłonowy.

Choroba Alzheimera

Korzystając z VINE-seq, badacze byli w stanie odkryć molekularne podstawy układu naczyniowego ludzkiego mózgu w chorobie Alzheimera (AD). Wykazali, że geny związane z chorobą Alzheimera są silnie eksprymowane w typach komórek naczyniowych oraz że występują zmiany w ekspresji genów lub utrata obfitości komórek śródbłonka , komórek mięśni gładkich i komórek okołonaczyniowych fibroblastów w próbkach mózgu chorych na AD w porównaniu z normalnymi próbkami mózgu.

Dalsze zastosowania

VINE-Seq został pierwotnie zaprojektowany do mapowania układu naczyniowego ludzkiego mózgu, ponieważ obecnie nie istnieje żadna mapa molekularna. Odkąd w 2021 roku dostępny był preprint artykułu wprowadzającego VINE-seq, mapa molekularna została doceniona za jej wkład w poszerzanie naszej wiedzy na temat unaczynienia mózgu, co pozwoli na bardziej dogłębne badania chorób mózgu i potencjalnie przezwyciężenia wyzwaniem dostarczania leku do mózgu. Niektóre zastosowania danych wygenerowanych przez VINE-seq przyczyniły się do poszerzenia naszej wiedzy na temat patogenezy AD, demencji , udaru niedokrwiennego oraz wpływ ciężkiego COVID-19 na mózg.

Zalety i wady

Zalety

  • Izoluje więcej jąder naczyń mózgowych niż poprzednie techniki izolacji pojedynczych jąder
  • Wychwytuje rzadsze komórki w układzie naczyniowym dzięki lepszej izolacji jąder
  • Minimalizuje efekt zmiany ekspresji genów poprzez unikanie dysocjacji enzymatycznej
  • Ma zastosowanie do zamrożonej zarchiwizowanej tkanki mózgowej

Niedogodności

  • Charakterystyka typów komórek jest ograniczona do znanych markerów jądrowych
  • Utrata cytoplazmatycznej informacji transkryptomicznej poprzez izolację jąder
  • Potencjalny wyciek z porów jądrowych RNA, a tym samym utrata niektórych kluczowych transkryptów RNA
Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=VINE-seq&oldid=1136390593 ”