Warunkowy nokaut genu
Warunkowy nokaut genu to technika stosowana w celu wyeliminowania określonego genu w określonej tkance, takiej jak wątroba. Ta technika jest przydatna do badania roli poszczególnych genów w organizmach żywych. Różni się od tradycyjnego nokautu genu, ponieważ jest ukierunkowany na określone geny w określonych momentach, a nie usuwany od początku życia. Zastosowanie techniki warunkowego nokautu genu eliminuje wiele skutków ubocznych tradycyjnego nokautu genu . W przypadku tradycyjnego nokautu genu śmierć embrionu w wyniku mutacji genu , co uniemożliwia naukowcom badanie genu u dorosłych. Niektórych tkanek nie można właściwie badać w izolacji, więc gen musi być nieaktywny w jednej tkance, podczas gdy pozostaje aktywny w innych. Dzięki tej technologii naukowcy są w stanie wyeliminować geny na określonym etapie rozwoju i zbadać, w jaki sposób wyeliminowanie genu w jednej tkance wpływa na ten sam gen w innych tkankach.
Technika
Najczęściej stosowaną techniką jest system rekombinacji Cre-lox. Enzym rekombinaza Cre specyficznie rozpoznaje dwa miejsca lox (loci rekombinacji) w DNA i powoduje rekombinację między nimi. Podczas rekombinacji dwie nici DNA wymieniają informacje. Ta rekombinacja spowoduje delecję lub inwersję genów między dwoma miejscami lox, w zależności od ich orientacji. Cały gen można usunąć, aby go zdezaktywować. Cały ten system jest indukowalny, więc można dodać substancję chemiczną, aby wybić geny w określonym czasie. Dwie z najczęściej stosowanych substancji chemicznych to tetracyklina, która aktywuje transkrypcję genu rekombinazy Cre i tamoksyfen, który aktywuje transport białka rekombinazy Cre do jądra. Tylko kilka typów komórek wykazuje ekspresję rekombinazy Cre i żadne komórki ssaków jej nie wyrażają, więc nie ma ryzyka przypadkowej aktywacji miejsc lox podczas stosowania warunkowego nokautu genu u ssaków. Ustalenie, jak wyrażać rekombinazę Cre w organizmie, jest zwykle najtrudniejszą częścią tej techniki.
Używa
Metoda warunkowego nokautu genów jest często stosowana do modelowania chorób ludzkich u innych ssaków. Zwiększyła zdolność naukowców do badania chorób, takich jak rak, które rozwijają się w określonych typach komórek lub stadiach rozwojowych. Wiadomo, że mutacje w genie BRCA1 są powiązane z rakiem piersi. Naukowcy wykorzystali warunkowy nokaut genu do usunięcia allelu BRCA1 w tkance gruczołu sutkowego u myszy i odkryli, że odgrywa on ważną rolę w supresji nowotworu.
Specyficzny gen w mózgu myszy , który uważa się za zaangażowany w początek choroby Alzheimera , który koduje enzym kinazę cyklinozależną 5 (Cdk5), został wyeliminowany. Stwierdzono, że takie myszy są "mądrzejsze" niż normalne myszy i są w stanie radzić sobie ze złożonymi zadaniami w bardziej inteligentny sposób niż "normalne" myszy hodowane w laboratorium.
Projekt myszy Knockout (KOMP)
Warunkowe nokauty genów u myszy są często wykorzystywane do badania chorób ludzi, ponieważ wiele genów wytwarza podobne fenotypy u obu gatunków. Przez ostatnie 100 lat wykorzystywano do tego genetykę myszy laboratoryjnych, ponieważ myszy są ssakami, które są fizjologicznie na tyle podobne do ludzi, że można przeprowadzić testy jakościowe. Ci dwaj mają tak podobne geny, że z 4000 badanych genów tylko 10 znaleziono u jednego gatunku, ale nie u drugiego. Wszystkie ssaki miały tego samego wspólnego przodka około 80 milionów lat temu; technicznie rzecz biorąc, wszystkie genomy ssaków są stosunkowo podobne. Jednak w porównaniu między myszami a ludźmi, ich regiony genomu kodujące białka są w 85% identyczne i wykazują podobieństwa między 99% ich homologów. Te podobieństwa skutkują podobnymi fenotypami, które mają być wyrażane między dwoma gatunkami. Ich geny są bardzo podobne do ludzkich, a 99% ma homologi podobne. Wraz z wytwarzaniem podobnych fenotypów, co czyni je bardzo obiecującymi kandydatami do warunkowego nokautu genów. Celem KOMP jest stworzenie mutacji knockout w embrionalnych komórkach macierzystych dla każdego z 20 000 genów kodujących białka u myszy. Geny są usuwane, ponieważ jest to najlepszy sposób na zbadanie ich funkcji i dowiedzenie się więcej o ich roli w chorobach człowieka. Istnieją dwie główne strategie warunkowego nokautu genów, a są to celowanie w geny lub rekombinacja homologiczna i pułapkowanie genów. Obie metody zwykle mają zmodyfikowany wektor wirusowy lub fragment liniowy jako sposób transportu sztucznego DNA do docelowej komórki ES. Komórki następnie rosną na szalce Petriego przez kilka dni i są wstawiane do zarodków we wczesnym stadium. Na koniec zarodki są umieszczane w macicy dorosłej samicy, gdzie może ona wyrosnąć na swoje potomstwo.[9] Niektóre allele w tym projekcie nie mogą zostać wyeliminowane tradycyjnymi metodami i wymagają specyfiki techniki warunkowego nokautu genów. Do usunięcia ostatnich pozostałych alleli potrzebne są inne metody kombinatoryczne. Warunkowe nokautowanie genów jest czasochłonną procedurą i istnieją dodatkowe projekty skupiające się na nokautowaniu pozostałych mysich genów. Współtwórca projektu KOMP, Oliver Smithies, prawdopodobnie wywarł największy naukowy wpływ na ukierunkowanie tego genu. Oliver otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za technikę umożliwiającą identyfikację funkcji w genach oraz sposób wykorzystania metody „knockout” do usunięcia określonych genów. Niestety, pionier w dziedzinie celowania w geny zmarł w wieku 91 lat 10 stycznia 2017 r.[11] Projekt KOMP rozpoczął się w 2006 roku i trwa do dziś. Repozytorium KOMP zapewnia zachęty dla osób biorących udział w projektach do przekazywania im informacji zwrotnych, a osobom, które spełniają określone kryteria, przysługuje zwrot 50% kosztów ich komórek badawczych.[10]
8. Austin, CP, Battey, JF, Bradley, A., Bucan, M., Capecchi, M., Collins, FS, Dove, WF, Duyk, G., Dymecki, S., Eppig, JT, Grieder, FB , Heintz, N., Hicks, G., Insel, TR, Joyner, A., Koller, BH, Lloyd, KC, Magnuson, T., Moore, MW, Nagy, A., … Zambrowicz, B. (2004) . Projekt nokautującej myszy. Genetyka przyrody, 36 (9), 921–924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921
9. Arkusz informacyjny myszy nokautujących. (nd). Pobrane z https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet
10. Lloyd KC (2011). Zasób myszy z nokautem dla społeczności badaczy biomedycznych. Annals of the New York Academy of Sciences, 1245, 24–26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x
11. Laureat Nagrody Nobla, dr Oliver Smithies, wygłosi wykład Earl H. Morris Endowed 10 lipca (nd). Pobrane z https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture
12. PZH. (nd). Dlaczego mysz ma znaczenie. Pobrane z https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome