Wektor transformacji roślin

Wektory do transformacji roślin to plazmidy zaprojektowane specjalnie w celu ułatwienia wytwarzania roślin transgenicznych. Najczęściej stosowane wektory do transformacji roślin nazywane są wektorami binarnymi ze względu na ich zdolność do replikacji zarówno w E. coli , powszechnej bakterii laboratoryjnej, jak i Agrobacterium tumefaciens , bakterii stosowanej do wstawiania rekombinowanego (dostosowanego) DNA do roślin. Wektory transformacji roślin zawierają trzy kluczowe elementy;

  • Selekcja plazmidów (tworzenie niestandardowej kolistej nici DNA)
  • Replikacja plazmidów (aby można było z nią łatwo pracować)
  • transferu DNA (T-DNA) (wstawienie DNA do agrobakterii)

Etapy transformacji roślin

Propaguj wektor binarny w E. coli

Wyizoluj wektor binarny z E.coli i zaprojektuj (wprowadź obcy gen)

Ponownie wprowadzić zmodyfikowany wektor binarny do E. coli w celu amplifikacji

Wyizoluj zmodyfikowany wektor binarny i wprowadź do Agrobacteria zawierającego zmodyfikowany (stosunkowo mały) plazmid Ti

Infekować tkankę roślinną zmodyfikowanymi Agrobacteria (T-DNA zawierający obcy gen zostaje wstawiony do genomu komórki roślinnej)

W każdej komórce T-DNA ulega integracji w innym miejscu genomu

Uwaga: istnieje wiele odmian tych kroków. Niestandardową sekwencję plazmidu DNA można utworzyć i replikować na więcej niż jeden sposób.

Konsekwencje wprowadzenia

Wprowadzono obce DNA

Mutageneza insercyjna (ale nie śmiertelna dla komórki roślinnej – organizm jest diploidalny)

Transformacyjny DNA podawany gryzoniom trafia do ich fagocytów i rzadko do innych komórek. W szczególności jest to DNA bakteryjny i M13 . (Uważa się, że ta preferencyjna akumulacja w fagocytach jest rzeczywista, a nie artefaktem wykrywania, ponieważ uważa się, że taka wielkość DNA prowokuje fagocytozę ). Jednakże nie wiadomo, czy nastąpiła żadna ekspresja genu i uważa się, że nie jest to możliwe.

Problem

Chcemy przekształcić cały organizm, a nie tylko jedną komórkę. Odbywa się to poprzez transformację komórek roślinnych w hodowli, selekcję transformowanych komórek i regenerację całej rośliny z transformowanej komórki (np. tytoniu).

Wybór plazmidu

Kiedy hoduje się bakterie z pożądanym, wszczepionym genem, wytwarza się je zawierające selektor. Selektor to sposób na izolowanie i rozróżnianie pożądanych komórek. Gen nadający komórkom oporność na antybiotyki, takie jak kanamycyna , ampicylina , spektynomycyna lub tetracyklina jest łatwym w użyciu selektorem. Pożądane komórki (wraz z innymi organizmami rosnącymi w hodowli) można leczyć antybiotykiem, co pozwala pożądanym komórkom przetrwać, podczas gdy inne organizmy nie mogą. Gen antybiotyku zwykle nie jest przenoszony do komórki roślinnej, ale pozostaje w komórce bakteryjnej.

Replikacja plazmidów

Plazmidy replikują się, wytwarzając wiele cząsteczek plazmidu w każdej komórce bakteryjnej gospodarza. Liczba kopii każdego plazmidu w komórce bakteryjnej zależy od miejsca rozpoczęcia replikacji . Jest to pozycja w cząsteczce plazmidu, w której rozpoczyna się replikacja DNA. Większość wektorów binarnych ma większą liczbę kopii plazmidu podczas replikacji w E. coli , liczba kopii plazmidu jest zwykle mniejsza, gdy plazmid znajduje się w obrębie Agrobacterium tumefaciens . Plazmidy można także replikować w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Region T-DNA

T-DNA zawiera dwa typy genów: geny onkogenne, kodujące enzymy biorące udział w syntezie auksyn i cytokinin oraz odpowiedzialne za powstawanie nowotworów; oraz geny kodujące syntezę opinii. Związki te, wytwarzane w wyniku kondensacji aminokwasów i cukrów, są syntetyzowane i wydalane przez komórki żółciowe korony i zużywane przez A. tumefaciens jako źródła węgla i azotu. Poza T-DNA zlokalizowane są geny katabolizmu opinii, geny biorące udział w procesie transferu T-DNA z bakterii do komórki roślinnej oraz geny biorące udział w transferze koniugacyjnym bakteria-plazmid bakteryjny. (Hooykaas i Schilperoort, 1992; Zupan i Zambrysky, 1995). Fragment T-DNA jest otoczony przez bezpośrednie powtórzenia o długości 25 bp, które działają jako sygnał elementu cis dla aparatu transferowego. W procesie transferu T-DNA pośredniczy kooperacyjne działanie białek kodowanych przez geny określone w regionie zjadliwości plazmidu Ti (geny vir) oraz w chromosomie bakteryjnym. Plazmid Ti zawiera także geny katabolizmu opinii wytwarzane przez komórki żółciowe korony i regiony odpowiedzialne za transfer koniugacyjny oraz własną integralność i stabilność. Region zjadliwości (vir) o wielkości 30 kb to regulon zorganizowany w sześć operonów, które są niezbędne do transferu T-DNA (virA, virB, virD i virG) lub do zwiększenia wydajności transferu (virC i virE) (Hooykaas i Schilperoort , 1992; Zupan i Zambryski, 1995, Jeon i in., 1998). Różne elementy genetyczne zdeterminowane chromosomami wykazały swoją funkcjonalną rolę w przyłączaniu A. tumefaciens do komórki roślinnej i kolonizacja bakteryjna: loci chvA i chvB, zaangażowane w syntezę i wydalanie β-1,2-glukanu (Cangelosi i in., 1989) chvE wymagane do wzmocnienia cukru w ​​​​indukcji genów vir oraz chemotaksję bakteryjną (Ankenbauer i in., 1990, Cangelosi i in., 1990, 1991) locus komórkowy odpowiedzialny za syntezę włókienek celulozowych (Matthysse 1983); locus pscA (exoC) odgrywa swoją rolę w syntezie zarówno cyklicznego glukanu, jak i kwaśnego sukcynoglikanu (Cangelosi i in. 1987, 1991) oraz locus att, który bierze udział w białkach powierzchni komórki (Matthysse, 1987).

Źródło: „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Plant_transformation_vector&oldid=1117157477 ”