Wieloogniskowa mikroskopia płaska
Mikroskopia wieloogniskowa (MUM) lub mikroskopia wielopłaszczyznowa lub mikroskopia wieloogniskowa jest formą mikroskopii świetlnej , która umożliwia śledzenie dynamiki 3D w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej poprzez jednoczesne obrazowanie różnych płaszczyzn ogniskowych w próbce. W tej metodologii światło zebrane z próbki przez soczewkę obiektywu z korekcją do nieskończoności jest podzielony na dwie ścieżki. W każdej ścieżce podzielone światło jest skupiane na detektorze, który jest umieszczony w określonej skalibrowanej odległości od soczewki tubusu. W ten sposób każdy detektor obrazuje odrębną płaszczyznę w próbce. Pierwsza opracowana konfiguracja MUM była w stanie zobrazować dwie odrębne płaszczyzny w próbce. Jednak konfigurację można zmodyfikować, aby obrazować więcej niż dwie płaszczyzny, dalej dzieląc światło na każdą ścieżkę światła i skupiając je na detektorach umieszczonych w określonych skalibrowanych odległościach. Został później ulepszony do obrazowania do czterech różnych płaszczyzn. Aby zobrazować większą liczbę płaszczyzn ogniskowych, opracowano prostsze techniki oparte na optyce podziału obrazu. Jednym z przykładów jest użycie dostosowanego pryzmatu rozdzielającego obraz, który jest w stanie uchwycić do 8 płaszczyzn ogniskowych przy użyciu tylko dwóch kamer. Co więcej, standardowe częściowe rozdzielacze wiązki mogą być użyte do skonstruowania tak zwanego pryzmatu z-splitter, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 9 indywidualnych płaszczyzn ogniskowania za pomocą jednej kamery. Inna technika zwana mikroskopią wieloogniskową (MFM) wykorzystuje dyfrakcyjną optykę Fouriera do obrazowania do 25 płaszczyzn ogniskowych.
Wstęp
Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek stanowi główne narzędzie w badaniu przypadków handlu ludźmi. Konwencjonalna konstrukcja mikroskopu jest dobrze przystosowana do obrazowania szybkiej dynamiki komórkowej w dwóch wymiarach, tj. w płaszczyźnie ogniskowej. Jednak komórki są obiektami trójwymiarowymi, a wewnątrzkomórkowe szlaki transportowe zazwyczaj nie są ograniczone do jednej płaszczyzny ogniskowej. Jeśli dynamika nie jest ograniczona do jednej płaszczyzny ogniskowej, konwencjonalna technologia mikroskopii jednopłaszczyznowej jest nieodpowiednia do szczegółowych badań szybkiej dynamiki wewnątrzkomórkowej w trzech wymiarach. Klasyczne podejścia oparte na zmianie płaszczyzny ogniskowej często nie są skuteczne w takich sytuacjach, ponieważ urządzenia ogniskujące są stosunkowo powolne w porównaniu z wieloma mechanizmami dynamiki wewnątrzkomórkowej. Ponadto płaszczyzna ogniskowa może często znajdować się w niewłaściwym miejscu w niewłaściwym czasie, przez co pomijane są ważne aspekty dynamicznych wydarzeń.
Realizacja
MUM można zaimplementować w dowolnym standardowym mikroskopie świetlnym . Przykładowa implementacja w mikroskopie Zeissa jest następująca. Podwójny adapter wideo Zeiss jest najpierw podłączany do bocznego portu mikroskopu Zeiss Axiovert 200. Dwie podwójne karty wideo Zeiss są następnie łączone poprzez podłączenie każdej z nich do portów wyjściowych pierwszej karty wideo Zeiss. Do każdego z połączonych adapterów wideo kamera CCD o wysokiej rozdzielczości jest mocowany za pomocą mocowania typu C/pierścieni dystansowych i wykonanego na zamówienie adaptera do kamery. Odstęp między portem wyjściowym karty wideo a kamerą jest różny dla każdej kamery, co powoduje, że kamery obrazują różne płaszczyzny ogniskowania.
Warto wspomnieć, że istnieje wiele sposobów na wdrożenie MUM. Wspomniana implementacja oferuje kilka zalet, takich jak elastyczność, łatwość instalacji i konserwacji oraz możliwość dopasowania do różnych konfiguracji. Ponadto dla wielu zastosowań ważna jest możliwość uzyskiwania obrazów w różnych kolorach przy różnych czasach naświetlania . Na przykład, aby zwizualizować egzocytozę w TIRFM , konieczna jest bardzo szybka akwizycja. Jednak, aby zobrazować znakowane fluorescencyjnie stacjonarne organelle w komórce, konieczne jest niskie wzbudzenie, aby uniknąć fotowybielania, w wyniku czego akwizycja musi być stosunkowo powolna. Pod tym względem powyższa implementacja oferuje dużą elastyczność, ponieważ różne kamery mogą być wykorzystywane do pozyskiwania obrazów w różnych kanałach.
Obrazowanie 3D w super rozdzielczości i śledzenie pojedynczych cząsteczek za pomocą MUM
Nowoczesne techniki mikroskopii wzbudziły duże zainteresowanie badaniem procesów komórkowych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Eksperymenty z pojedynczą cząsteczką przezwyciężają skutki uśredniania i dlatego dostarczają informacji, które nie są dostępne przy użyciu konwencjonalnych badań masowych. Jednak lokalizacja 3D i śledzenie pojedynczych cząsteczek stwarza kilka wyzwań. Oprócz tego, czy można uchwycić obrazy pojedynczej cząsteczki, gdy przechodzi ona potencjalnie wysoce złożoną dynamikę 3D, pojawia się pytanie, czy można określić lokalizację 3D pojedynczej cząsteczki i jak dokładnie można to zrobić.
Główną przeszkodą w szacowaniu lokalizacji 3D z dużą dokładnością jest słaba dyskryminacja głębokości standardowego mikroskopu. Nawet przy obiektywie o dużej aperturze numerycznej obraz źródła punktowego w konwencjonalnym mikroskopie nie zmienia się zauważalnie, jeśli źródło punktowe zostanie przesunięte o kilkaset nanometrów od jego ogniska. To sprawia, że niezwykle trudno jest określić położenie osiowe, tj. położenie z źródła punktowego za pomocą konwencjonalnego mikroskopu.
Mówiąc bardziej ogólnie, ilościowa mikroskopia pojedynczych cząsteczek dla próbek 3D stwarza ten sam problem niezależnie od tego, czy jest to mikroskopia lokalizacyjna/śledząca, czy mikroskopia superrozdzielcza, taka jak PALM, STORM, FPALM, dSTORM dla zastosowań 3D, tj. trzy wymiary. MUM oferuje kilka korzyści. W MUM obrazy źródła punktowego są pozyskiwane jednocześnie na różnych poziomach ostrości. Te obrazy dostarczają dodatkowych informacji, których można użyć do ograniczenia pozycji z źródła punktowego. Te ograniczające informacje w dużej mierze rozwiązują problem dyskryminacji głębokości w pobliżu ogniska.
Miara lokalizacji 3D zapewnia ilościową miarę dokładności lokalizacji źródła punktowego może być zdeterminowany. Mała wartość liczbowa miary lokalizacji 3D implikuje bardzo dużą dokładność określania lokalizacji, podczas gdy duża wartość liczbowa miary lokalizacji 3D implikuje bardzo małą dokładność określania lokalizacji. W przypadku konwencjonalnego mikroskopu, gdy źródło punktowe znajduje się blisko płaszczyzny ogniskowania, np. z0 <= 250 nm, miara lokalizacji 3D przewiduje bardzo słabą dokładność oszacowania pozycji z. Dlatego w konwencjonalnym mikroskopie śledzenie 3D jest problematyczne, gdy źródło punktowe znajduje się blisko płaszczyzny ostrości.
Z drugiej strony, w przypadku dwupłaszczyznowej konfiguracji MUM miara lokalizacji 3D przewiduje konsekwentnie lepszą dokładność niż konwencjonalny mikroskop dla zakresu wartości z, zwłaszcza gdy źródło punktowe znajduje się blisko płaszczyzny ostrości. Bezpośrednią konsekwencją tego wyniku jest to, że położenie z źródła punktowego można określić z relatywnie takim samym poziomem dokładności dla zakresu wartości z, co jest korzystne dla śledzenia pojedynczych cząstek w 3D .
Dwuobiektywowa wieloogniskowa mikroskopia płaska (dMUM)
W zastosowaniach do obrazowania pojedynczych cząstek liczba fotonów wykrytych ze znacznika fluorescencyjnego odgrywa kluczową rolę w ilościowej analizie uzyskanych danych. Obecnie eksperymenty ze śledzeniem cząstek są zwykle przeprowadzane na mikroskopie odwróconym lub pionowym, w którym pojedyncza soczewka obiektywu oświetla próbkę, a także zbiera z niej sygnał fluorescencyjny. Należy zauważyć, że chociaż emisja fluorescencji z próbki zachodzi we wszystkich kierunkach (tj. nad i pod próbką), użycie pojedynczej soczewki obiektywu w tych konfiguracjach mikroskopu powoduje zbieranie światła tylko z jednej strony próbki. Nawet jeśli używana jest soczewka obiektywu o dużej aperturze numerycznej, nie wszystkie fotony emitowane po jednej stronie próbki mogą zostać zebrane ze względu na skończony kąt zbierania soczewki obiektywu. Dlatego nawet w najlepszych warunkach obrazowania konwencjonalne mikroskopy rejestrują tylko ułamek fotonów emitowanych z próbki.
Aby rozwiązać ten problem, można zastosować konfigurację mikroskopu, która wykorzystuje dwie przeciwstawne soczewki obiektywowe, przy czym jeden z obiektywów znajduje się w pozycji odwróconej, a drugi w pozycji pionowej. Ta konfiguracja nazywana jest dwuobiektywową wieloogniskową mikroskopią płaszczyznową (dMUM).