Wyświetlacz CRISPR
CRISPR-Display ( CRISP-Disp ) to modyfikacja systemu CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) do edycji genomu. System CRISPR/Cas9 wykorzystuje sekwencję krótkiego przewodnika RNA (sgRNA) do kierowania Cas9 Streptococcus pyogenes , działającą jako programowalne białko wiążące DNA, w celu rozszczepienia DNA w interesującym miejscu.
Natomiast CRISPR-Display wykorzystuje Cas9 z niedoborem nukleazy (dCas9) i zmodyfikowany sgRNA z aptamerycznymi dodatkowymi domenami RNA, w zakresie od 100 pz do 5 kb, poza normalną komplementarną sekwencją kierującą. Domeny pomocnicze RNA mogą być domenami funkcjonalnymi, takimi jak długie niekodujące RNA ( lncRNA ), motywy wiążące białka lub znaczniki epitopowe do immunochemii. Pozwala to na badanie funkcjonalności niektórych lncRNA i kierowanie rybonukleoprotein (RNP) do loci genomowych.
CRISPR-Display został po raz pierwszy opublikowany w Nature Methods w lipcu 2015 r. i opracowany przez Davida M. Shechnera, Ezgi Hacisuleymana, Scotta T. Youngera i Johna Rinna z Uniwersytetu Harvarda i Massachusetts Institute of Technology (MIT) w USA.
Tło
System CRISPR/Cas9 jest oparty na adaptacyjnym układzie odpornościowym organizmów prokariotycznych, a jego zastosowanie do edycji genomu zostało po raz pierwszy zaproponowane i opracowane we współpracy Jennifer Doudna ( University of California, Berkeley ) i Emmanuelle Charpentier ( Max Planck Institute for Infection Biology , Niemcy). Metoda i jej zastosowanie w edycji komórek ludzkich zostały opublikowane w Science 17 sierpnia 2012 r. W styczniu 2013 r. laboratorium Feng Zhang w Broad Institute na MIT opublikowało w Science kolejną metodę, która dodatkowo zoptymalizowała strukturę i ekspresję sgRNA dla zastosowanie w komórkach ssaków. Do początku 2014 roku opublikowano prawie 2500 opracowań, które w tytule wymieniają CRISPR.
Niekodujące RNA (ncRNA) to transkrypty RNA, które nie ulegają translacji na produkt białkowy, ale pełnią swoją funkcję jako cząsteczki RNA. Są zaangażowane w szereg procesów, takich jak potranskrypcyjna regulacja ekspresji genów, imprinting genomowy i regulacja stanu chromatyny, a tym samym ekspresji danego locus. Odkryto wiele ncRNA, ale w wielu przypadkach ich funkcja nie została jeszcze dokładnie zbadana ze względu na wyzwania techniczne. Na funkcję ncRNA często nie wpływa wprowadzenie mutacji punktowych i przedwczesnych kodonów stop. Uważa się również, że ncRNA regulują ekspresję genów, więc badania delecji mają trudności z odróżnieniem skutków utraty ncRNA od skutków nieprawidłowej regulacji genów spowodowanej delecją. Badania ncRNA również nie miały przepustowości niezbędnej do rozpoznania funkcjonalności opartej na RNA. Aby sprostać tym wyzwaniom, laboratorium Rinn opracowało zatem podejście do biologii syntetycznej, wykorzystując system CRISPR/Cas9, z Cas9 działającym jako kanał, aby kierować moduły ncRNA do ektopowych lokalizacji genomowych i badać wpływ ncRNA na geny reporterowe i inne cechy genomowe w tym miejscu.
Rozwój metody
CRISPR-Disp modyfikuje technologię CRISPR/Cas9 poprzez wykorzystanie nieaktywnego katalitycznie, tj. pozbawionego nukleazy, mutanta Cas9 (dCas9) i zmianę RNA używanego do kierowania Cas9 do lokalizacji genomowej.
Ponieważ sgRNA są zwykle wyrażane przez polimerazę RNA III , która ogranicza długość domeny RNA, którą można wstawić, CRISPR-Display zawiera polimerazę RNA II , aby umożliwić ekspresję dłuższych transkryptów (~ 80–250 nukleotydów) w celu przezwyciężenia tego ograniczenia. CRISPR-Display może zatem dodawać większe domeny RNA, takie jak domeny naturalne i lncRNA, bez wpływu na lokalizację dCas9.
SgRNA jest modyfikowany z aptameryczną domeną pomocniczą RNA w sekwencji poza sekwencją kierującą. W opracowaniu tej techniki wykorzystano pięć modelowych kofaktorów o różnych konstruktach topologicznych: TOP1-4 i INT z domeną pomocniczą (domena P4-P6) w różnych pozycjach, w tym na końcu 5' i 3' oraz wewnętrznie w obrębie sgRNA. Każda domena zawierała pętlę łodygi, którą można rozpoznać po białku otoczki bakteriofaga PP7. Kompleks wprowadzono do komórek ssaków (komórki HEK293FT) za pomocą wektora lentiwirusowego .
Aby upewnić się, że dołączony moduł RNA zachowuje zarówno funkcję kierowania, jak i wynikającą z tego kompleksową aktywację transkrypcji w określonym miejscu zainteresowania, zmierzono przejściową ekspresję genu reporterowego lucyferazy i białka fluorescencyjnego. Przeprowadzono dwie odmiany takiego testu aktywatora transkrypcji ; bezpośrednio z dCas9 połączonym z aktywatorem/represorem transkrypcji (VP64, czynnik, o którym wiadomo, że wzmacnia ekspresję genów) (aktywacja bezpośrednia) lub pośrednio, gdzie aktywator transkrypcji jest połączony z modułem białka wiążącego RNA na sgRNA (aktywacja mostkowa) . Aktywacja genu reporterowego poprzez bezpośrednią aktywację implikuje, że wariant sgRNA skutecznie wiąże i celuje w dCas9. Wszystkie pięć topologii wykazało bezpośrednią aktywację, z wyjątkiem TOP3 i TOP4, które wykazały zmniejszoną aktywność. Aktywacja mostkowa wskazuje, że połączona domena dodatkowa RNA jest nienaruszona w dojrzałych kompleksach dCas9. Aktywację mostkową zaobserwowano dla TOP1, TOP3 i INT. Wyniki podsumowano w endogennych loci przez ukierunkowanie minimalnego sgRNA i selektywnych rozszerzonych topologii (TOP1 i INT) na ludzkie promotory ASCL1, IL1RN, NTF3 i TTN. Bezpośrednią i mostkowaną aktywację obserwowano metodą qRT-PCR dla każdego konstruktu, co dowodzi, że CRISP-Disp umożliwia rozmieszczenie dużych domen RNA w loci genomowych.
Wpływ wielkości insercji wewnętrznej (łodyga-pętla) na kompleks dCas9 oceniano przy użyciu konstruktów podobnych do INT z kasetami pętli łodygi PP7 o wielkości w zakresie od 25 nt do 247 nt. Każdy konstrukt indukował znaczącą aktywację w testach reporterowych, co oznacza, że rozmiar wewnętrznej insercji nie wpływa na funkcję kompleksu dCas9. Podobnie, wpływ wewnętrznej sekwencji wstawki określono również za pomocą zestawu unikalnych wariantów sgRNA prezentujących kasety 25 losowych nukleotydów. Testy reporterowe i RIP-Seq potwierdziły, że sekwencja nie reguluje złożonej skuteczności.
Użyteczność CRISP-Disp zbadano za pomocą szeregu funkcjonalnych domen RNA, takich jak motywy wiążące naturalne białka, sztuczne aptamery i małe cząsteczki o różnej wielkości. Chociaż wszystkie kompleksy były funkcjonalne i żywotne oraz z powodzeniem rozmieszczały domeny RNA w endogennych loci, skuteczność zmieniała się wraz z długością i poziomami ekspresji. Sugeruje to, że optymalizacja struktury i sekwencji może być ważna przed zaprojektowaniem konstrukcji.
Aby określić, czy sztuczne rusztowania lncRNA mogą być używane z wyświetlaczem CRISPR, kompleksy dCas9 zostały połączone ze sztucznym RNA o wielkości porównywalnej z lncRNA. Konstrukty rozszerzono do rozmiaru ~650 nt z dodatkową domeną P4-P6 z pętlami spinki do włosów, które mogą być rozpoznawane przez inne białko otoczki faga, MS2. Te konstrukcje topologiczne nazwano podwójnymi TOP0-2 z dwiema domenami razem na końcu 5' lub 3' lub oddzielnie na każdym końcu. Przejściowe testy reporterowe, a następnie potwierdzenie immunoprecypitacyjnym RNA (RIP-qPCR) wykazały, że wszystkie trzy konstrukty zachowały obie domeny w kompleksie.
Zostało to również przetestowane z naturalnymi domenami lncRNA poprzez zbudowanie kierowanych przez Pol II konstruktów TOP1 i INT połączonych z ludzkimi domenami lncRNA. Użyte lncRNA miały długość między ~ 90–4800 nt i obejmowały pRNA wiążące NoRC, trzy RNA transkrybowane przez wzmacniacze (eRNA) FALEC, TRERNA1 i ncRNA-a3), powtórzenie Xist A (RepA) i transkrypcję 4799 - nt aktywator HOTTIP . Podczas gdy wszystkie konstrukty wykazywały znaczną aktywację bezpośrednią, zmniejszała się ona wraz ze wzrostem długości lncRNA-sgRNA. Te domeny lncRNA mogą regulować reportery niezależne od dCas9 z pRNA i RepA tłumiącymi ekspresję reportera GLuc (represory) i aktywacją indukującą TRERNA1, ncRNA-a3 i HOTTIP (aktywatory), ale zostały odpowiednio ukierunkowane na ektopową lokalizację zainteresowania za pomocą CRISP -Dystrybucja systemu.
W ten sposób CRISP-Disp umożliwia kontrolę ekspresji genów za pomocą rozmieszczenia zarówno sztucznych rusztowań, jak i naturalnych domen lncRNA.
Aplikacje
CRISPR-Display umożliwia wcześniej niedostępne badania funkcjonalności lncRNA, sztucznej funkcjonalizacji ncRNA, rekrutację endogennych i zmodyfikowanych białek do loci genomowych oraz znakowanie powinowactwa locus do obrazowania komórek.
Lokalizacja domeny lncRNA
CRISPR-Display umożliwia ukierunkowaną lokalizację naturalnych lncRNA w miejscach ektopowych w celu zbadania ich funkcji. Wystawienie różnych ektopowych loci DNA na naturalne lncRNA może pomóc w wykazaniu wpływu lncRNA na ekspresję genów i stan chromatyny oraz pomóc w analizie mechanizmu takich efektów. Jednym z głównych nierozwiązanych pytań w badaniu lncRNA jest to, czy wpływ na stan chromatyny lub ekspresję genów sąsiadujących z locus lncRNA wynika z funkcjonalnych, specyficznych dla sekwencji mechanizmów samego lncRNA, czy też wynika po prostu z aktu transkrypcji lncRNA. Lokalizacja lncRNA w miejscach ektopowych za pomocą CRISPR-Display może pomóc w oddzieleniu funkcji samego RNA od skutków transkrypcji takich gatunków RNA. Przed CRISPR-Display takie badania były trudne ze względu na niską przepustowość i niemożność odróżnienia funkcji lncRNA od innych czynników zakłócających, takich jak kryptograficznie zakodowane peptydy lub funkcjonalne elementy DNA.
Sztuczna funkcjonalizacja ncRNA
CRISPR-Display pozwala również na ukierunkowane wykorzystanie szerokiej gamy sztucznych RNA o określonej funkcjonalności, takich jak RNA do rekrutacji endogennych białek wiążących RNA, znakowania powinowactwa przeciwciał i rekrutacji znakowanych białek fuzyjnych.
Znakowanie powinowactwa do obrazowania żywych komórek
Jednym z przykładów sztucznej funkcjonalizacji ncRNA jest włączenie domen RNA rozpoznawanych przez specyficzne przeciwciała przeciwko sgRNA. CRISPR-Display może kierować sgRNA z określoną sekwencją epitopu do różnych loci, a znakowane fluorescencyjnie przeciwciała można wykorzystać do obrazowania locus, pokazując jego lokalizację w jądrze i możliwe interakcje z innymi znakowanymi białkami lub loci genomowymi.
Rekrutacja endogennych lub modyfikowanych białek wiążących RNA do regulacji genów
Endogenne białka, o których wiadomo, że wiążą określony motyw RNA, można rekrutować do ektopowych lokalizacji genomowych poprzez włączenie motywu RNA do sgRNA. CRISPR-Display może również rekrutować białka fuzyjne zaprojektowane w celu wiązania określonych sekwencji RNA. Rekrutacja tych białek może pozwolić na badanie wpływu określonych białek i kompleksów białkowych na regulację genów i stany chromatyny, a także specyficzną regulację niektórych genów w celu zbadania funkcji genów.
Multipleksowane badania funkcjonalne
Ze względu na modułowość sgRNA, kilka różnych sgRNA o różnych modułach funkcjonalnych może być eksprymowanych jednocześnie w każdej komórce. Różne moduły RNA mogą wówczas działać jednocześnie i niezależnie, umożliwiając na przykład regulację jednej lokalizacji genomu, jednocześnie obrazując skutki regulacji w innej lokalizacji.
Możliwości zastosowań CRISPR-Display będą się zwiększać wraz z dalszym rozwojem i zrozumieniem funkcjonalizacji ncRNA. Nie jest nierozsądne sądzić, że CRISPR-Display może pewnego dnia umożliwić złożone systemy biologii syntetycznej, z wyraźną czasową ekspresją sgRNA oraz sieciami i obwodami regulacji genów poprzez ukierunkowanie na białka regulatorowe.
Zalety
- Może z łatwością pomieścić duży ładunek RNA (do ~ 4,8 kb, być może nawet większy) w rdzeniu sgRNA. Dlatego ustrukturyzowane domeny RNA, naturalne długie lncRNA, sztuczne moduły RNA i pule losowych sekwencji mogą być używane z dCas9.
- Kompleksowanie sgRNA-dCas9 nie jest ograniczone składem sekwencji ładunku RNA, ale wydaje się niezależne od zastosowanych modułów RNA.
- CRISPR-Display to metoda modułowa, która umożliwia jednoczesne wykonywanie różnych funkcji w różnych loci w tej samej komórce. Wykorzystanie pojedynczego konstruktu z ortogonalnymi białkami wiążącymi RNA, gdzie każde białko jest połączone z unikalną domeną funkcjonalną i jest kierowane przez sgRNA zawierające powiązany motyw RNA. (multipleksowanie) (już zawarte w aplikacjach)
- Moduły RNA można dodawać w różnych miejscach w sekwencji sgRNA (wewnętrznie lub na końcach 5' lub 3'), dzięki czemu można zoptymalizować lokalizację modułu RNA lub zapewnić najlepszą jego funkcję.
- Umożliwia budowę kompleksów Cas9 z kasetami wiążącymi białka, sztucznymi aptamerami, pulami losowych sekwencji oraz naturalnymi lncRNA.
Ograniczenia
- Wyświetlanie CRISPR jest obecnie ograniczone liczbą dostępnych funkcjonalnych motywów RNA i funkcji białek wiążących RNA. W miarę odkrywania i opracowywania większej liczby takich motywów i białek możliwe mogą być dalsze zastosowania CRISPR-Display.
- Kompleks dCas9 zmniejsza się wraz ze wzrostem długości sgRNA-lncRNA. Ilościowe wydajności nienaruszonych domen lncRNA są jednak odzyskiwane w stosunku do odpowiedniego sgRNA. Dlatego integralność konstruktu może zależeć od czynników, takich jak długość i struktura RNA.
- Projekt wysokowydajnego konstruktu CRISPR-Display może wymagać pewnej optymalizacji strukturalnej lub sekwencji, co może prowadzić do zmiennej skuteczności konstruktu.