Wyjście mitotyczne
Wyjście mitotyczne jest ważnym punktem przejściowym, który oznacza koniec mitozy i początek nowej fazy G1 dla komórki, a komórka musi polegać na określonych mechanizmach kontrolnych, aby zapewnić, że po wyjściu z mitozy nigdy nie powróci do mitozy, dopóki nie przeszedł przez fazy G1, S i G2 i przeszedł wszystkie niezbędne punkty kontrolne. Wiele czynników, w tym cykliny , kinazy cyklinozależne (CDK), ligazy ubikwitynowe , inhibitory kinaz cyklinozależnych i odwracalne fosforylacje regulują wyjście mitotyczne, aby zapewnić, że zdarzenia cyklu komórkowego zachodzą we właściwej kolejności z jak najmniejszą liczbą błędów. Koniec mitozy charakteryzuje się rozpadem wrzeciona, skróceniem kinetochoru i wyraźnym wzrostem mikrotubul astralnych (nie kinetochoru). W normalnej komórce eukariotycznej wyjście mitotyczne jest nieodwracalne.
Degradacja proteolityczna
Poczyniono wiele spekulacji w odniesieniu do mechanizmów kontrolnych wykorzystywanych przez komórkę do promowania nieodwracalności wyjścia mitotycznego w eukariotycznym organizmie modelowym, pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae . Proteolityczna degradacja regulatorów cyklu komórkowego i odpowiadający jej wpływ na poziomy kinaz zależnych od cyklin została zaproponowana jako mechanizm promujący cykl komórkowy eukariotyczny, aw szczególności przejście z metafazy do anafazy. W tej teorii kompleks promujący anafazę (APC), klasa ligaz ubikwitynowych, ułatwia degradację cyklin mitotycznych (Clb2) i czynników hamujących anafazę (PDS1, CUT2) w celu promowania wyjścia mitotycznego. APC ubikwitynuje dziewięcioaminokwasowy motyw znany jako pole destrukcji (ramka D) w domenie NH2-końcowej cyklin mitotycznych w celu degradacji przez proteasom. APC w połączeniu z Cdc20 (APC-Cdc20) ubikwitynuje i celuje w cykliny mitotyczne (Clb2) w celu degradacji w fazie początkowej. Jednocześnie APC-Cdc20 pośredniczy w degradacji sekuryn , które hamują separazy poprzez wiązanie, na początku anafazy. Uwolniona i aktywna separaza rozszczepia kohezynę, która utrzymywała razem chromatydy siostrzane, ułatwiając rozdzielanie chromatyd siostrzanych i inicjuje wyjście mitotyczne poprzez promowanie uwalniania Cdc14 z jąderka. W późniejszej fazie regulacja w dół Cdk1 i aktywacja Cdc14, fosfatazy aktywującej Cdh1, sprzyja tworzeniu APC w połączeniu z Cdh1 (APC-Cdh1) w celu degradacji Clb2. Cdc20 i Cdh1, które są aktywatorami APC, rekrutują substraty, takie jak sekuryna i cykliny typu B (Clb) do ubikwitynacji. Bez kompleksów Cdk1-Clb2 do fosforylacji białek zaangażowanych w dynamikę wrzeciona, takich jak Sli15, Ase1 i Ask1 , promowane jest wydłużenie wrzeciona i segregacja chromosomów, ułatwiając wyjście mitotyczne. Znaczenie degradacji proteolitycznej w cyklu komórkowym eukariotycznym zmieniło pogląd na podział komórki jako prostą kaskadę kinazy na bardziej złożony proces, w którym konieczne są interakcje między fosforylacją, ubikwitynacją i proteolizą. Jednak eksperymenty z użyciem pączkujących komórek drożdży z cdc28-as1, allelem Cdk wrażliwym na INM-PP1 (analog ATP), dowiodły, że zniszczenie cyklin typu B (Clb) nie jest konieczne do wywołania nieodwracalnego wyjścia mitotycznego. Degradacja Clb2 skróciła okres hamowania Cdk1 wymagany do wywołania nieodwracalnego wyjścia mitotycznego, co wskazuje, że proteoliza cykliny przyczynia się do dynamicznego charakteru cyklu komórkowego eukariotycznego ze względu na wolniejszą skalę czasową jej działania, ale jest mało prawdopodobne, aby była głównym czynnikiem determinującym wyzwalanie nieodwracalnego cyklu komórkowego przejścia.
Poziomy Sic1
Dokonano odkryć wskazujących na znaczenie poziomu inhibitorów kinaz cyklinozależnych w regulacji cyklu komórkowego eukariotów. W szczególności poziom Sic1 Wykazano, że stechiometryczny inhibitor kompleksów Clb-CDK w pączkujących drożdżach jest szczególnie ważny w nieodwracalnym przejściu G1-S poprzez nieodwracalną aktywację kinaz fazy S. Wykazano, że poziom Sic1 odgrywa główną rolę w wyzwalaniu nieodwracalnego wyjścia mitotycznego (przejście M-G1), jak również w przejściu G1-S. Podczas mitozy zmniejszający się poziom Cdk1 prowadzi do aktywacji Cdc14, fosfatazy, która przeciwdziała Cdk1 poprzez aktywację Cdh1 i Swi5, aktywatora transkrypcji białek Sic1. Podczas gdy degradacja Sic1 do pewnego niskiego poziomu wyzwalała początek fazy S, akumulacja Sic1 do pewnego wysokiego poziomu była wymagana do wywołania nieodwracalnego wyjścia mitotycznego. Inhibitory Cdk1 mogą indukować wyjście mitotyczne nawet wtedy, gdy degradacja cyklin typu B była blokowana przez ekspresję nieulegających degradacji inhibitorów Clbs lub proteasomów. Jednak chromatydy siostrzane nie uległy segregacji, a komórki powróciły do mitozy po wypłukaniu inhibitorów, co wskazuje, że należy osiągnąć poziom progowy inhibitorów, aby wywołać nieodwracalne wyjście mitotyczne niezależnie od degradacji cyklin. Pomimo różnych progów poziomu Sic1, które są wymagane do wywołania wyjścia mitotycznego w porównaniu z przejściem G1-S, wykazano, że poziom Sic1 odgrywa kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego eukariotycznego poprzez hamowanie aktywności CDK.
Podejście systemów dynamicznych
Ponieważ cykl komórkowy eukariotyczny obejmuje różnorodne białka i interakcje regulacyjne, można przyjąć podejście systemów dynamicznych, aby uprościć złożony obwód biologiczny w ogólne ramy dla lepszej analizy. Spośród czterech możliwych relacji wejścia / wyjścia, związek między poziomem Sic1 a wyjściem mitotycznym wydaje się wykazywać cechy nieodwracalnego przełącznika bistabilnego, napędzanego sprzężeniem zwrotnym między APC-Cdh1, Sic1 i Clb2-Cdk1. bistabilność kontroluje funkcje biologiczne, takie jak kontrola cyklu komórkowego i różnicowanie komórek, i odgrywa kluczową rolę w wielu komórkowych sieciach regulacyjnych. Bistabilna relacja wejście/wyjście charakteryzuje się dwoma stanami stabilnymi z dwoma punktami bifurkacji. Możliwych jest wiele wyjść dla jednego określonego wejścia w obszarze bistabilności, oznaczonym dwoma punktami bifurkacji. Dodatkowo w relacji bistabilnej występuje histereza: stan końcowy/wyjście zależy od historii wejścia oraz aktualnej wartości wejścia, ponieważ układ posiada pamięć. Jeden punkt bifurkacji ma ujemną wartość parametru kontrolnego (punkt bifurkacji znajduje się po drugiej stronie osi), co powoduje rozłączenie między dwoma stanami stabilnymi i nieodwracalność przejścia z jednego stanu w drugi. Jeśli chodzi o wyjście mitotyczne, dwa stabilne stany są określone przez mitozę i fazę G1. Gdy poziom Sic1 (wejściowy) zgromadzi się poza próg, następuje nieodwracalne przejście z mitozy (stan stabilny I) do fazy G1 (stan stabilny II). W niedoskonałym środowisku jedyne rozwidlenie, które pozostaje nienaruszone, to bifurkacja węzła siodłowego . Bifurkacja siodło-węzeł nie załamuje się (oczekiwanym ogólnym zachowaniem jest siodło-węzeł), podczas gdy bifurkacje transkrytyczne i widłowe załamują się w obecności niedoskonałości. Zatem jedyną jednowymiarową bifurkacją, jaka może istnieć w niedoskonałym świecie biologicznym, jest bifurkacja siodło-węzeł. Bistabilny związek między przejściem M-G1 a poziomem Sic1 można przedstawić jako diagram dwóch bifurkacji siodło-węzeł, w których zachowanie systemu zmienia się jakościowo przy niewielkiej zmianie parametru kontrolnego, ilości Sic1.
Informacje zwrotne na poziomie systemów
Ponieważ zachowanie cyklu komórkowego krytycznie zależy od ilości Sic1 w stanie przejściowym M-G1, ilość Sic1 jest ściśle regulowana przez sprzężenia zwrotne na poziomie systemu. Ponieważ Cdk1-Clb2 hamuje Sic1 przez fosforylację Sic1 i udostępnianie Sic1 do degradacji poprzez wszechobecność, zależna od APC-Cdh1 degradacja Cdk1-Clb2 nie tylko zmniejsza poziom dostępnych kompleksów Cdk1-Clb2, ale także zwiększa poziom Sic1, co z kolei dalej hamuje funkcję Cdk1-Clb2. Ta aktywacja podwójnej pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego jest inicjowana przez zależną od APC-Cdc20 degradację Cdk1-Clb2 i uwalnianie Cdc14 z białka jąderkowego Net1/Cfi1. Szlak FEAR (wczesne uwalnianie anafazy Cdc14) ułatwia zależną od Clb2-Cdk1 fosforylację Net1, która przejściowo uwalnia Cdc14 z Net1. Uwolnione kompleksy Cdc14 i Clb2-Cdk1 przechodzą na wrzeciona, które aktywują mitotyczną sieć wyjściową (MEN). MEN umożliwia przedłużone uwalnianie Cdc14 z jąderka, a Cdc14 przeciwdziała aktywności Clb2-Cdk1 poprzez aktywację Cdh1 i stabilizację Sic1 poprzez aktywację aktywatora transkrypcji Sic1 Swi5. Sic1 pozytywnie reguluje się poprzez hamowanie Cdk1-Clb2 w celu uwolnienia hamowania Swi5, a Cdh1 również pozytywnie reguluje się poprzez hamowanie Clb2-Cdk1 w celu uwolnienia hamowania MEN, które może aktywować Cdc14, a następnie sam Cdh1. Podwójnie ujemna pętla sprzężenia zwrotnego, utworzona przez APC-Cdh1 i Sic1, jest wymagana do utrzymania niskiej aktywności Clb2-Cdk1, ponieważ Clb2 automatycznie aktywuje swoją syntezę poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych, Fkh2– Mcm1 Ndd1.
Implikacje
Cykl komórkowy eukariota składa się z różnych punktów kontrolnych i pętli sprzężenia zwrotnego, aby zapewnić wierny i pomyślny podział komórek. Na przykład podczas mitozy, gdy zduplikowane chromosomy są nieprawidłowo przyłączone do wrzeciona mitotycznego, punktu kontrolnego składania wrzeciona (SAC), w tym Mad i Bub, hamują APC-Cdc20, opóźniając wejście w anafazę i degradację cyklin typu B. Ponadto, gdy wrzeciona mitotyczne są źle ustawione, MEN, a następnie Cdc14 są hamowane w sposób zależny od Bub2 i Bfa1, aby zapobiec degradacji cyklin mitotycznych i wejściu do anafazy. Sic1 to dobry przykład pokazujący, w jaki sposób sprzężenia zwrotne na poziomie systemów oddziałują na siebie, aby wyczuć warunki środowiskowe i wywołać przejścia cyklu komórkowego. Chociaż rzeczywiste przejście M-G1 jest bardzo złożone i obejmuje wiele białek i regulacji, podejście systemów dynamicznych pozwala uprościć ten złożony system do bistabilnej relacji wejście/wyjście z dwoma bifurkacjami siodło-węzeł, w których wyjście (wyjście mitotyczne) zależy od stężenia krytycznego z Sic1. Korzystając z analizy jednowymiarowej, możliwe może być wyjaśnienie wielu nieodwracalnych punktów przejściowych w cyklu komórkowym eukariotycznym, które są regulowane przez kontrolę i sprzężenie zwrotne na poziomie systemu. Inne przykłady nieodwracalnych punktów przejściowych obejmują Start (nieodwracalne zaangażowanie w nowy cykl podziału komórki), który można wytłumaczyć nieodwracalnym przełącznikiem bistabilnym, którego parametr kontrolny jest ściśle regulowany przez systemowe sprzężenia zwrotne obejmujące Cln2, Whi5 i SBF.