immunoperoksydaza
Immunoperoksydaza to rodzaj immunostainu stosowany w biologii molekularnej , badaniach medycznych i diagnostyce klinicznej. W szczególności, reakcje immunoperoksydazowe odnoszą się do podklasy procedur immunohistochemicznych lub immunocytochemicznych, w których przeciwciała są wizualizowane poprzez reakcję katalizowaną peroksydazą.
Immunohistochemia i immunocytochemia to metody stosowane do określenia, w których komórkach lub częściach komórek znajduje się określone białko lub inna makrocząsteczka . Plamy te wykorzystują przeciwciała do wiązania się z określonymi antygenami , zwykle pochodzenia białkowego lub glikoproteinowego . Ponieważ przeciwciała są zwykle niewidoczne, należy zastosować specjalne strategie wykrywania tych związanych przeciwciał. W procedurze immunoperoksydazy katalizowania stosuje się enzym znany jako peroksydaza reakcja chemiczna prowadząca do powstania barwnego produktu.
Po prostu bardzo cienki skrawek tkanki mocuje się na szkle, inkubuje z przeciwciałem lub serią przeciwciał, z których ostatnie jest chemicznie związane z peroksydazą. Po wywołaniu plamy przez dodanie substratu chemicznego rozmieszczenie plamy można zbadać pod mikroskopem .
Rodzaje przeciwciał
Pierwotnie wszystkie przeciwciała wytwarzane do barwienia immunologicznego były poliklonalne , tj. wytwarzane w wyniku normalnych reakcji przeciwciał u zwierząt, takich jak konie lub króliki. Obecnie wiele z nich jest monoklonalnych , tj. produkowanych w kulturach tkankowych. Przeciwciała monoklonalne, które składają się tylko z jednego typu przeciwciał, zwykle zapewniają większą specyficzność antygenową, a także są bardziej spójne między partiami.
Metody barwienia immunoperoksydazą
Pierwszym etapem barwienia immunoperoksydazą jest wiązanie swoistego (pierwotnego) przeciwciała z próbką komórki lub tkanki. Wykrywanie pierwszorzędowego przeciwciała można następnie przeprowadzić bezpośrednio (przykład 1) lub pośrednio (przykłady 2 i 3).
- Przykład 1. Pierwszorzędowe przeciwciało można bezpośrednio znakować enzymem peroksydazą , który jest następnie używany do katalizowania reakcji chemicznej w celu wytworzenia barwnego produktu.
- Przykład 2. Pierwotne przeciwciało można znakować małą cząsteczką, która może być rozpoznawana przez cząsteczkę wiążącą skoniugowaną z peroksydazą z wysokim powinowactwem. Najczęstszym tego przykładem jest biotyną , które wiąże się ze streptawidyną związaną z enzymem . Tej metody można użyć do wzmocnienia sygnału.
- Przykład 3. Nieznakowane przeciwciało pierwszorzędowe jest wykrywane przy użyciu ogólnego przeciwciała drugorzędowego , które rozpoznaje wszystkie przeciwciała pochodzące od tego samego gatunku zwierząt co pierwszorzędowe. Drugorzędowe przeciwciało jest znakowane peroksydazą.
Optymalne barwienie zależy od wielu czynników, w tym rozcieńczenia przeciwciała, chemikaliów barwiących, przygotowania i/lub utrwalenia komórek/tkanek oraz długości inkubacji z przeciwciałami/odczynnikami barwiącymi. Są one często określane raczej metodą prób i błędów niż jakimkolwiek systematycznym podejściem.
Alternatywy dla barwników peroksydazowych
Zamiast peroksydaz można stosować inne enzymy katalityczne, takie jak fosfataza alkaliczna, zarówno w bezpośrednich, jak i pośrednich metodach barwienia. Alternatywnie, przeciwciało pierwszorzędowe można wykryć za pomocą znacznika fluorescencyjnego ( immunofluorescencja ) lub przyczepić do koloidalnych cząstek złota w mikroskopii elektronowej .
Zastosowania barwienia immunoperoksydazą
Barwienie immunoperoksydazą znajduje zastosowanie w diagnostyce klinicznej oraz w badaniach laboratoryjnych .
W diagnostyce klinicznej barwienie immunologiczne może być stosowane w biopsjach tkanek w celu bardziej szczegółowych badań histopatologicznych . W przypadku raka może pomóc w podklasyfikacji guzów. Immunobarwienie można również wykorzystać do diagnozowania chorób skóry, zapalenia kłębuszków nerkowych i do klasyfikacji złogów amyloidowych . Pokrewne techniki są również przydatne w podtypowaniu limfocytów , które wszystkie wyglądają dość podobnie w mikroskopie świetlnym.
W badaniach laboratoryjnych przeciwciała przeciwko specyficznym markerom różnicowania komórkowego mogą być używane do znakowania poszczególnych typów komórek. Może to umożliwić lepsze zrozumienie zmian mechanistycznych w określonych liniach komórkowych wynikających z określonej interwencji eksperymentalnej.