promotor PBAD

Rycina 1. Ekspresja araB , araA i araC w obecności arabinozy. W obecności arabinozy, arabinoza wiąże się z miejscami kieszonkowymi wiązania arabinozy w AraC, powodując dimeryzację AraC w operatorach I ₁ i I ₂ . Umożliwia to dostęp CAP do wiązania się z miejscami wiążącymi CAP, co z kolei pomaga rekrutować polimerazę RNA zarówno do promotorów P _BAD , jak i _{PC oraz aktywuje transkrypcję.}

P _BAD (systematycznie araBp ) jest promotorem występującym w bakteriach , a zwłaszcza jako część plazmidów stosowanych w badaniach laboratoryjnych. Promotor jest częścią operonu arabinozowego , którego nazwa pochodzi od genów , które reguluje transkrypcję : araB , araA i araD . W E. coli promotor P _BAD sąsiaduje z promotorem PC ₍ systematycznie araCp ), który dokonuje transkrypcji genu araC w przeciwnym kierunku. araC koduje białko AraC , które reguluje aktywność zarówno promotorów P _BAD , jak i _PC . Białko CAP cyklicznego receptora AMP wiąże się między promotorami P _BAD i _PC , stymulując transkrypcję obu, gdy są związane przez cAMP.

Rozporządzenie P _BAD

Inicjacja transkrypcji na promotorze P _BAD zachodzi w obecności wysokich stężeń arabinozy i niskich stężeń glukozy . Po związaniu arabinozy z AraC, N-końcowe ramię AraC jest uwalniane z domeny wiążącej DNA poprzez mechanizm „przełącznika światła”. Pozwala to AraC na dimeryzację i wiązanie operatorów I ₁ i I ₂ . Dimer AraC-arabinoza w tym miejscu przyczynia się do aktywacji promotora P _BAD . Dodatkowo CAP wiąże się z dwoma miejscami wiązania CAP powyżej operatorów I ₁ i I ₂ i pomaga aktywować promotor P _BAD . Jednak w obecności zarówno wysokich stężeń arabinozy, jak i glukozy, niskie poziomy cAMP uniemożliwiają CAP aktywację promotora P _BAD . Przypuszcza się, że aktywacja promotora P _BAD przez CAP i AraC odbywa się za pośrednictwem kontaktów między C-końcową domeną podjednostki α polimerazy RNA a białkami CAP i AraC.

Rycina 2. Ekspresja araB , araA i araC nie występuje, gdy arabinoza nie jest obecna. Pod nieobecność arabinozy, AraC dimeryzuje, będąc związanym z miejscami operatora O2 _i I1 _, zapętlając DNA. Pętla zapobiega wiązaniu CAP i polimerazy RNA, które normalnie aktywują transkrypcję zarówno P _BAD , jak i _PC .

Bez arabinozy i niezależnie od stężenia glukozy promotory P _BAD i _PC są tłumione przez AraC. N-końcowe ramię AraC oddziałuje z jego domeną wiążącą DNA, umożliwiając dwóm białkom AraC związanie się z _O2 i _I1 . Operator O2 znajduje się w obrębie _genu araC . Dimer AraC również wiąże się z operatorem O ₁ i hamuje promotor _PC poprzez ujemne sprzężenie zwrotne autoregulacyjne pętla. Dwa związane białka AraC dimeryzują i powodują zapętlenie DNA. Pętla zapobiega wiązaniu CAP i polimerazy RNA, które normalnie aktywują transkrypcję zarówno P _BAD , jak i _PC .

Transkrypcja P. BAD	Wysoka arabinoza	Niska arabinoza
Wysoka glukoza	Stłumiony	Stłumiony
Niski poziom glukozy	Aktywny	Stłumiony

Odstęp między miejscami operatorów O2 _i I1 _jest krytyczny. Dodanie lub usunięcie 5 par zasad między miejscami operatorów O2 _i I1 _znosi pośredniczoną przez AraC represję promotora P _BAD . Wymagania dotyczące odstępów wynikają z natury podwójnej helisy DNA , w której pełny obrót helisy wynosi około 10,5 nukleotydu . Dlatego dodanie lub usunięcie 5 par zasad między O ₂ a I ₁ strony operatora obracają helisę o mniej więcej 180 stopni. To odwraca kierunek, w którym stoi operator O2, _gdy DNA jest zapętlony i zapobiega dimeryzacji AraC związanego z O2 _ze związanym _I1 araC .

P _BAD na plazmidach ekspresyjnych

Figura 3. Reprezentacja promotora PBAD 33 na plazmidzie ze wspólnymi regionami działającymi w układzie cis. Skróty definiuje się jako pochodzenie fagemidu (pochodzenie f1), oporność na chloramfenikol (CmR), pochodzenie plazmidu (p15A ori), gen araC (araC), miejsca operatora araC (araC O2 i O1), miejsce wiązania CAP (CAP BS), miejsca indukujące araC (I1/I2), promotor PBAD (pBAD) i miejsce wielokrotnego klonowania (MCS).

P _BAD pozwala na ścisłą regulację i kontrolę docelowego genu in vivo . Jak wyjaśniono powyżej, P _BAD jest regulowany przez dodanie i brak arabinozy . Jak przetestowano, promotor można dalej tłumić przy obniżonych poziomach cAMP przez dodanie glukozy. Skonstruowano i przetestowano wektory plazmidowe z markerem selekcyjnym ( w tym przypadku Cm ^{R ),} początkiem replikacji , araC i operonami, miejscem wielokrotnego klonowania i P _ZŁY promotor. Badania pokazują, że wektory ulegają silnej ekspresji i mogą być używane w połączeniu z chromosomalnymi allelami zerowymi do badania utraty funkcji niezbędnych genów.