ChiRP-Seq
ChiRP-Seq (Chromatin Isolation by RNA purification) to wysokowydajna metoda sekwencjonowania służąca do odkrywania regionów genomu , które są związane specyficznym RNA (lub rybonukleoproteiną zawierającą interesujący RNA). Ostatnie badania wykazały, że znaczna część niektórych genomów (w tym genomy myszy i ludzi) syntetyzuje RNA, które najwyraźniej nie kodują białek. Funkcja większości z tych niekodujących RNA wciąż wymaga ustalenia. Opracowywane są różne metody genomiczne w celu mapowania funkcjonalnego powiązania tych nowych RNA z różnymi regionami genomu w celu lepszego zrozumienia ich funkcji. ChiRP-Seq jest jedną z tych nowych metod, która wykorzystuje zdolność masowego sekwencjonowania równoległego sekwencerów drugiej generacji do katalogowania miejsc wiązania tych nowych cząsteczek RNA w genomie.
Chociaż wielu uważało, że RNA kodują głównie białka, bardzo duża część genomu eukariotycznego składa się z RNA, które tego nie robią. Te RNA były pierwotnie uważane za śmieci, dopóki nowe postępy nie doprowadziły do uświadomienia sobie, że rzeczywiście mogą mieć cel biologiczny. W ciągu ostatnich kilku lat lncRNA były najmniej zbadanymi i funkcjonalnie scharakteryzowanymi pojawiającymi się cząsteczkami regulatorowymi, zwłaszcza w porównaniu z ich krótkimi odpowiednikami, małymi ncRNA. ChiRP-Seq to nowa technika, która pozwoliła nam zmapować obłożenie długiego RNA w całym genomie w rozdzielczości wyższej niż kiedykolwiek wcześniej. ChiRP-Seq działa poprzez wychwytywanie powinowactwa docelowego kompleksu lncRNA i chromatyny przez układanie antysensownych oligonukleotydów. Technika ta pozwoli naukowcom na bardzo dokładne wygenerowanie mapy genomowych miejsc wiązania kilkuset zasad ze względu na dużą czułość i niskie tło.
Przegląd metody
Dziesiątki sond oligonukleotydowych zaprojektowano tak, aby były komplementarne do RNA będącego przedmiotem zainteresowania. Te oligonukleotydy są znakowane biotyną . Komórki są sieciowane za pomocą UV lub formaliny , a jądra są izolowane z tych traktowanych komórek. Wyizolowane jądra poddano lizie, a uwolnioną chromatynę fragmentowano przez sonikację w celu wytworzenia fragmentów o wielkości około 100-500 bp. Te fragmenty chromatyny hybrydyzowano z zestawem biotynylowanych sond. Kompleksy zawierające sondę biotynową + interesujący RNA + fragment DNA są wychwytywane przez kulki magnetyczne znakowane streptawidyną .
DNA izoluje się z porcji związanego kompleksu przez traktowanie RNAzą (lub proteinazą, a następnie RNAzą) w celu strawienia związanego białka i RNA. RNA można również wyizolować z dodatkowej porcji związanego kompleksu w celu wykrycia innych cząsteczek RNA związanych z RNA będącym przedmiotem zainteresowania. Oczyszczone DNA jest następnie wykorzystywane do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania, a biblioteka jest sekwencjonowana w systemie sekwencjonowania DNA nowej generacji. Odczyty sekwencjonowania są następnie mapowane do genomu. Nagromadzenie odczytów w określonych miejscach genomu wskazuje, że interesujący RNA związał się z tym regionem genomu. Pomaga to nakreślić określone regiony genomowe, które oddziałują z RNA. Na przykład genomowe cele wzmacniacza RNA, które działają w pewnej odległości od ich miejsca syntezy, można łatwo ocenić za pomocą ChiRP-Seq.