oligonukleotyd

Oligonukleotydy to krótkie cząsteczki DNA lub RNA , oligomery , które mają szeroki zakres zastosowań w testach genetycznych , badaniach i kryminalistyce . Te małe cząsteczki kwasów nukleinowych, powszechnie wytwarzane w laboratorium na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej, mogą być wytwarzane jako jednoniciowe cząsteczki o dowolnej sekwencji określonej przez użytkownika, a zatem są niezbędne do sztucznej syntezy genów , reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), DNA sekwencjonowanie , klonowanie molekularne i jako sondy molekularne . W naturze oligonukleotydy występują zwykle jako małe cząsteczki RNA, które działają w regulacji ekspresji genów (np. mikroRNA ) lub są produktami pośrednimi degradacji pochodzącymi z rozpadu większych cząsteczek kwasu nukleinowego.

Oligonukleotydy charakteryzują się sekwencją reszt nukleotydowych , które tworzą całą cząsteczkę. Długość oligonukleotydu jest zwykle oznaczana przez „ -mer ” (z greckiego meros , „część”). Na przykład oligonukleotyd składający się z sześciu nukleotydów (nt) jest heksamerem, podczas gdy jeden z 25 nukleotydów byłby zwykle nazywany „25-merem”. Oligonukleotydy łatwo wiążą się, w sposób specyficzny dla sekwencji, z odpowiednimi komplementarnymi oligonukleotydami, DNA lub RNA, tworząc dupleksy lub, rzadziej, hybrydy wyższego rzędu. Ta podstawowa właściwość służy jako podstawa do wykorzystania oligonukleotydów jako sond do wykrywania określonych sekwencji DNA lub RNA. Przykłady procedur wykorzystujących oligonukleotydy obejmują mikromacierze DNA , Southern blot , analizę ASO , fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), PCR i syntezę sztucznych genów.

Oligonukleotydy składają się z 2'-dezoksyrybonukleotydów (oligodeoksyrybonukleotydów), które można modyfikować w szkielecie lub w pozycji cukru 2', aby uzyskać różne efekty farmakologiczne. Modyfikacje te nadają oligonukleotydom nowe właściwości i czynią je kluczowym elementem terapii antysensownej .

Synteza

Oligonukleotydy są syntetyzowane chemicznie przy użyciu bloków budulcowych, chronionych amidofosforanów naturalnych lub chemicznie modyfikowanych nukleozydów lub, w mniejszym stopniu, związków nienukleozydowych. Składanie łańcucha oligonukleotydowego przebiega w kierunku od 3' do 5' zgodnie z rutynową procedurą określaną jako „cykl syntezy”. Zakończenie pojedynczego cyklu syntezy skutkuje dodaniem jednej reszty nukleotydowej do rosnącego łańcucha. Mniej niż 100% wydajności każdego etapu syntezy oraz występowanie reakcji ubocznych wyznaczają praktyczne granice wydajności procesu. Na ogół sekwencje oligonukleotydowe są zwykle krótkie (o długości 13-25 nukleotydów). Maksymalna długość syntetycznych oligonukleotydów prawie nie przekracza 200 reszt nukleotydowych. Do izolowania produktów o pożądanej sekwencji można zastosować HPLC i inne metody.

Modyfikacje chemiczne

Stworzenie stabilnych chemicznie krótkich oligonukleotydów było najwcześniejszym wyzwaniem w opracowywaniu terapii ASO. Naturalnie występujące oligonukleotydy są łatwo rozkładane przez nukleazy, enzym, który rozszczepia nukleotydy i występuje w dużych ilościach w każdym typie komórek. Krótkie sekwencje oligonukleotydowe mają również słabe wewnętrzne powinowactwo wiązania, co przyczynia się do ich degradacji in vivo.

Modyfikacje kręgosłupa

Nukleozydowe tiofosforanowe (PS) analogi nukleotydów nadają oligonukleotydom pewne korzystne właściwości. Kluczowymi korzystnymi właściwościami, jakie szkielety PS nadają nukleotydom, są diastereoizomerów każdego nukleotydu oraz zdolność do łatwego śledzenia reakcji z udziałem nukleotydów tiofosforanowych, co jest przydatne w syntezie oligonukleotydów. Modyfikacje szkieletu PS oligonukleotydów chronią je przed niepożądaną degradacją przez enzymy. Modyfikowanie szkieletu nukleotydowego jest szeroko stosowane, ponieważ można to osiągnąć ze względną łatwością i dokładnością w przypadku większości nukleotydów. Doniesiono, że modyfikacje fluorescencyjne na końcach 5' i 3' oligonukleotydów oceniają struktury, dynamikę i interakcje oligonukleotydów w odniesieniu do środowiska.

Modyfikacje pierścieni cukrowych

Inną modyfikacją przydatną w zastosowaniach medycznych oligonukleotydów są modyfikacje 2'cukru . Modyfikowanie cukru w pozycji 2' zwiększa skuteczność oligonukleotydów poprzez zwiększenie zdolności oligonukleotydów do wiązania celu, szczególnie w terapiach oligonukleotydami antysensownymi . Zmniejszają również niespecyficzne wiązanie białek, zwiększając dokładność celowania w określone białka. Dwie najczęściej stosowane modyfikacje to 2'-O-metyl i 2'-O-metoksyetyl. Zgłoszono również fluorescencyjne modyfikacje zasady nukleinowej.

oligonukleotydy antysensowne

Antysensowne oligonukleotydy (ASO) to pojedyncze nici DNA lub RNA, które są komplementarne do wybranej sekwencji. W przypadku antysensownego RNA zapobiegają one translacji białek pewnych informacyjnych nici RNA , wiążąc się z nimi w procesie zwanym hybrydyzacją . Antysensowne oligonukleotydy można stosować do kierowania na specyficzny, komplementarny (kodujący lub niekodujący ) RNA. Jeśli zachodzi wiązanie, ta hybryda może zostać zdegradowana przez enzym RNazę H . RNaza H jest enzymem, który hydrolizuje RNA, a zastosowany w aplikacji antysensownego oligonukleotydu powoduje obniżenie ekspresji mRNA o 80-95%.

Zastosowanie antysensownych oligonukleotydów Morpholino do usuwania genów u kręgowców , które jest obecnie standardową techniką w biologii rozwojowej i jest wykorzystywane do badania zmienionej ekspresji genów i funkcji genów, zostało po raz pierwszy opracowane przez Janet Heasman przy użyciu Xenopus . Zatwierdzone przez FDA leki Morpholino obejmują eteplirsen i golodirsen . Antysensowne oligonukleotydy stosowano również do hamowania replikacji wirusa grypy w liniach komórkowych.

Choroby neurodegeneracyjne, które są wynikiem pojedynczego zmutowanego białka, są dobrymi celami dla antysensownych terapii oligonukleotydowych ze względu na ich zdolność do celowania i modyfikowania bardzo specyficznych sekwencji RNA z wysoką selektywnością. Wiele chorób genetycznych, w tym choroba Huntingtona , choroba Alzheimera , choroba Parkinsona i stwardnienie zanikowe boczne (ALS), zostało powiązanych ze zmianami DNA, które skutkują nieprawidłowymi sekwencjami RNA i błędną translacją białek, które mają toksyczny efekt fizjologiczny.

Internalizacja komórki

Pobieranie/internalizacja komórek nadal stanowi największą przeszkodę na drodze do skutecznych terapii ON. Bezpośrednie wchłanianie, podobnie jak w przypadku większości leków małocząsteczkowych, jest utrudnione przez szkielet polianionowy i rozmiar cząsteczkowy ON. Dokładne mechanizmy wychwytu i transportu wewnątrzkomórkowego w kierunku miejsca działania są nadal w dużej mierze niejasne. Co więcej, niewielkie różnice w strukturze/modyfikacji ON (vide supra) i różnice w typie komórek prowadzą do ogromnych różnic w wychwycie. Uważa się, że wychwyt komórkowy zachodzi na różnych szlakach po adsorpcji ON na powierzchni komórki. Warto zauważyć, że badania pokazują, że większość komórek hodowli tkankowej łatwo pobiera ASO (wiązanie fosforotionianowe) w sposób nieproduktywny, co oznacza, że nie obserwuje się efektu antysensownego. W przeciwieństwie do tego koniugacja ASO z ligandami rozpoznawanymi przez receptory sprzężone z G prowadzi do zwiększonego wychwytu produktywnego. Poza tą klasyfikacją (nieprodukcyjna vs. produktywna), internalizacja komórkowa przebiega głównie w sposób zależny od energii (endocytoza za pośrednictwem receptora), ale nie można wykluczyć biernej dyfuzji niezależnej od energii (= gimnoza). Po przejściu przez błonę komórkową leki ON są wcześnie zamykane w kapsułkach endosomy , które są transportowane w kierunku późnych endosomów, które ostatecznie ulegają fuzji z lizosomami zawierającymi enzymy rozkładające przy niskim pH. Aby pełnić swoją funkcję terapeutyczną, ON musi wydostać się z endosomu przed jego degradacją. Do dziś nie ma uniwersalnej metody przezwyciężenia problemów związanych z dostarczaniem, pobieraniem komórek i ucieczką endosomalną, ale istnieje kilka podejść, które zawsze są dostosowane do konkretnych komórek (w tym ich receptorów).

Koniugacja środków terapeutycznych ON z jednostką odpowiedzialną za rozpoznawanie/wychwyt przez komórki nie tylko zwiększa wychwyt (vide supra), ale uważa się również, że zmniejsza złożoność wychwytu przez komórki, ponieważ wtedy bierze udział głównie jeden (idealnie znany) mechanizm. Osiągnięto to za pomocą koniugatów drobnocząsteczkowych ON, na przykład zawierających N-acetylogalaktozaminę , która celuje w receptory hepatocytów . Te koniugaty są doskonałym przykładem uzyskiwania zwiększonego wychwytu komórkowego w połączeniu z ukierunkowanym dostarczaniem, ponieważ odpowiednie receptory ulegają nadekspresji na komórkach docelowych, co prowadzi do ukierunkowanego leku (porównaj koniugaty przeciwciało-lek, które wykorzystują nadeksprymowane receptory na komórkach nowotworowych). Inną szeroko stosowaną i intensywnie badaną jednostką do ukierunkowanego dostarczania i zwiększonego wychwytu oligonukleotydów przez komórki są przeciwciała .

Techniki analityczne

Chromatografia

Alkiloamidy mogą być stosowane jako chromatograficzne fazy stacjonarne. Fazy te zbadano pod kątem rozdziału oligonukleotydów. Wysokosprawna chromatografia cieczowa z parami jonów w odwróconym układzie faz służy do rozdzielania i analizy oligonukleotydów po zautomatyzowanej syntezie.

Spekrtometria masy

Mieszanina kwasu 5-metoksysalicylowego i sperminy może służyć jako matryca do analizy oligonukleotydów w spektrometrii masowej MALDI . Spektrometria mas z jonizacją ElectroSpray (ESI-MS) jest również potężnym narzędziem do charakteryzowania masy oligonukleotydów.

mikromacierz DNA

Mikromacierze DNA są użytecznym analitycznym zastosowaniem oligonukleotydów. W porównaniu ze standardowymi mikromacierzami cDNA , mikromacierze oparte na oligonukleotydach mają bardziej kontrolowaną specyficzność w porównaniu z hybrydyzacją oraz zdolność do pomiaru obecności i częstości występowania sekwencji alternatywnie składanych lub poliadenylowanych . Jeden podtyp mikromacierzy DNA można opisać jako podłoża (nylon, szkło itp.), z którymi związano oligonukleotydy z dużą gęstością. Istnieje wiele zastosowań mikromacierzy DNA w naukach przyrodniczych.

Zobacz też

Aptamery , oligonukleotydy o ważnych zastosowaniach biologicznych
Morpholinos , oligo z nienaturalnymi szkieletami, które nie aktywują RNazy-H, ale mogą zmniejszać ekspresję genów lub modyfikować splicing RNA
Polimorfizm , pojawienie się w populacji tego samego genu w wielu formach z powodu mutacji; często można testować sondami ASO
Oligodeoksynukleotyd CpG , ODN o właściwościach immunostymulujących
Polipuryny odwrócone spinki do włosów Hoogsteena , PPRH, oligonukleotydy, które mogą wiązać DNA lub RNA i zmniejszać ekspresję genów.

Dalsza lektura

Spingler B (styczeń 2012). „Rozdział 3. Zmiany konformacyjne oligonukleotydów promowane przez jony metali”. W Sigel A, Sigel H, Sigel RK (red.). Wzajemne oddziaływanie jonów metali i kwasów nukleinowych . Jony metali w naukach przyrodniczych . Tom. 10. Springer Science & Business Media. s. 103–118. doi : 10.1007/978-94-007-2172-2_3 . PMID 22210336 .

Linki zewnętrzne

Atlas RNAi : baza danych bibliotek RNAi i wyników ich analizy docelowej
physorg.com | Zneutralizowano genetyczne źródło dystrofii mięśniowej