Czynnik hamujący CFTR
Czynnik hamujący CFTR ( Cif ) jest białkowym czynnikiem wirulencji wydzielanym przez bakterie Gram-ujemne Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter nosocomialis . Odkryty w Dartmouth Medical School , Cif jest w stanie zmienić transport wybranych transporterów ABC w eukariotycznych komórkach nabłonkowych , takich jak regulator przewodnictwa przezbłonowego mukowiscydozy (CFTR) i glikoproteina P poprzez zakłócanie mechanizmu deubikwitynacji gospodarza. Promując ubikwityny , Cif jest w stanie fenokopować mukowiscydozę na poziomie komórkowym. Gen cif jest transkrybowany jako część operonu genowego 3 , którego ekspresja jest regulowana negatywnie przez CifR, represor z rodziny TetR .
Komórkowy mechanizm działania
Cif został po raz pierwszy odkryty przez wspólną hodowlę P. aeruginosa z ludzkimi komórkami nabłonka dróg oddechowych i monitorowanie wynikającego z tego wpływu na wypływ jonów chlorkowych przez spolaryzowaną monowarstwę. Po współhodowli stwierdzono, że specyficzny dla CFTR wypływ jonów chlorkowych został drastycznie zmniejszony. Stwierdzono, że jest to spowodowane obniżonymi poziomami CFTR na wierzchołkowej powierzchni tych komórek. Później odkryto, że efekt ten był wynikiem pojedynczego wydzielanego białka wytwarzanego przez P. aeruginosa , które nazwano czynnikiem hamującym CFTR dla tego początkowego fenotypu . Cif jest wydzielany przez P. aeruginosa PA14 jako rozpuszczalne białko, jak również pakowane do pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV). Cif jest znacznie silniejszy, gdy jest stosowany w OMV, prawdopodobnie ze względu na skuteczność dostarczania. Oczyszczone, rekombinowane białko Cif można zastosować do spolaryzowanych monowarstw komórek ssaków i promować usuwanie CFTR i P-glikoproteiny z błony wierzchołkowej . Cif osiąga to poprzez ingerowanie w system deubikwitylacji hosta.
Mechanizm enzymatyczny hydrolazy epoksydowej
Cif jest hydrolazą epoksydową (EH) o wyjątkowej selektywności substratowej. Cif jest pierwszym przykładem EH służącym jako czynnik wirulencji. Na podstawie porównania strukturalnego wydaje się, że enzym wykorzystuje katalityczną triadę reszt Asp129, Glu153 i His297, z dodatkowymi resztami His177 i Tyr239 koordynującymi tlen epoksydowy podczas otwierania pierścienia. Cif jest również pierwszym przykładem EH wykorzystującego parę His-Tyr do koordynowania podłoża epoksydowego zamiast kanonicznej pary Tyr-Tyr. W proponowanym mechanizmie enzymatycznym Asp129 nukleofilowo atakuje węgiel ugrupowania epoksydowego substratu, tworząc związek pośredni enzym-acyl połączony estrem. Preferencje, dla których węgiel jest atakowany, różnią się w zależności od podłoża. W drugim etapie reakcji cząsteczka wody jest aktywowana przez parę przekaźników ładunku His297-Glu153 i przechodzi atak nukleofilowy na Cγ Asp129. To hydrolizuje grupę estrową, uwalniając produkt hydrolizy jako wicynalny diol.
Struktura
Cif należy do rodziny białek hydrolaz α/β . Jego strukturę określono za pomocą krystalografii rentgenowskiej i składa się z kanonicznego fałdu hydrolazy α/β z domeną czapeczki, którą wykorzystuje do konstytutywnej homodimeryzacji w roztworze. Miejsce aktywne jest zakopane we wnętrzu białka na granicy między rdzeniem hydrolazy α/β a czapeczką.