Degradacja Edmana
Degradacja Edmana , opracowana przez Pehra Edmana , jest metodą sekwencjonowania aminokwasów w peptydzie . W tej metodzie reszta aminokońcowa jest znakowana i odcinana od peptydu bez rozrywania wiązań peptydowych między innymi resztami aminokwasowymi.
Mechanizm
Izotiocyjanian fenylu poddaje się reakcji z nienaładowaną N-końcową grupą aminową, w warunkach łagodnie alkalicznych, z wytworzeniem cyklicznej pochodnej fenylotiokarbamoilu . Następnie w kwaśnych ta pochodna końcowego aminokwasu jest rozszczepiana jako pochodna tiazolinonu. Aminokwas tiazolinonu jest następnie selektywnie ekstrahowany do rozpuszczalnika organicznego i traktowany kwasem w celu wytworzenia bardziej stabilnej pochodnej aminokwasu fenylotiohydantoiny (PTH), którą można zidentyfikować za pomocą chromatografii lub elektroforezy . Procedurę tę można następnie powtórzyć, aby zidentyfikować następny aminokwas. Główną wadą tej techniki jest to, że peptydy sekwencjonowane w ten sposób nie mogą mieć więcej niż 50 do 60 reszt (aw praktyce poniżej 30). Długość peptydu jest ograniczona ze względu na cykliczną derywatyzację, która nie zawsze kończy się. Problem derywatyzacji można rozwiązać przez rozszczepienie dużych peptydów na mniejsze peptydy przed przystąpieniem do reakcji. Jest w stanie dokładnie zsekwencjonować do 30 aminokwasów za pomocą nowoczesnych maszyn zdolnych do ponad 99% wydajności na aminokwas . Zaletą degradacji Edmana jest to, że wykorzystuje ona tylko 10 - 100 pikomoli peptydu do procesu sekwencjonowania. Reakcja degradacji Edmana została zautomatyzowana w 1967 roku przez Edmana i Beggsa w celu przyspieszenia procesu, a do 1973 roku na całym świecie było używanych 100 zautomatyzowanych urządzeń.
Ograniczenia
Ponieważ degradacja Edmana zachodzi od N-końca białka, nie zadziała, jeśli N-koniec został zmodyfikowany chemicznie (np. przez acetylację lub utworzenie kwasu piroglutaminowego ). Sekwencjonowanie zostanie zatrzymane, jeśli napotkany zostanie nie-α-aminokwas (np. kwas izoasparaginowy ), ponieważ nie jest możliwe utworzenie preferowanego pięcioczłonowego pierścienia pośredniego. Degradacja Edmana generalnie nie jest przydatna do określania pozycji mostków dwusiarczkowych. Wymaga również ilości peptydów wynoszącej 1 pikomol lub więcej, aby uzyskać dostrzegalne wyniki.
Analiza sprzężona
Po 2D SDS PAGE białka można przenieść na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) do dalszej analizy. Degradacje Edmana można przeprowadzić bezpośrednio z membrany PVDF. Sekwencjonowanie reszty N-końcowej dające pięć do dziesięciu aminokwasów może być wystarczające do zidentyfikowania białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI).