Elektroforeza swobodnego przepływu

Elektroforeza swobodnego przepływu (FFE) , znana również jako elektroforeza bez nośnika , jest techniką rozdziału elektroforetycznego bez matrycy . FFE jest techniką analogiczną do elektroforezy kapilarnej , z porównywalną rozdzielczością, którą można stosować w przypadku pytań naukowych, w których potrzebne są próbki półpreparatywne i preparatywne. Służy do ilościowego rozdzielania próbek według różnicy ładunków lub punktu izoelektrycznego. istnieje szeroki zakres protokołów rozdzielania próbek, takich jak jony metali rzadkich , izoformy białek , kompleksy wielobiałkowe , peptydy , organelle , komórki , origami DNA , surowica krwi i nanocząsteczki . Zaletą FFE jest szybka i delikatna separacja próbek rozpuszczonych w ciekłym rozpuszczalniku bez potrzeby stosowania matrycy, takiej jak poliakryloamid w elektroforezie żelowej . Zapewnia to bardzo wysoki stopień odzysku, ponieważ anality nie przylegają do żadnego nośnika ani struktury matrycy. Ze względu na ciągły charakter i dużą przepustowość, technika ta pozwala na szybkie rozdzielanie preparatywnych ilości próbek z bardzo wysoką rozdzielczością. Ponadto rozdziały można prowadzić w warunkach natywnych lub denaturujących.

Historia

FFE został opracowany w latach 60. XX wieku przez Kurta Hanniga w Instytucie Maxa Plancka w Niemczech. Do lat 80. XX wieku była to znormalizowana technologia separacji komórek i organelli , a FFE był nawet testowany w kosmosie, aby zminimalizować sedymentację w warunkach zerowej grawitacji . Gdy cytometria przepływowa stała się standardową metodą sortowania komórek, rozwój FFE koncentrował się na rozdzielaniu białek i cząstek naładowanych. Niektóre grupy pracują również nad zminiaturyzowanymi wersjami systemów FFE lub mikro FFE.

Technika

Komora separacji składa się z płyty tylnej i płyty czołowej. Tylna płyta zwykle składa się z chłodzonego bloku aluminiowego, pokrytego szklanym lustrem pokrytym tworzywem sztucznym. Płyta czołowa jest obecnie wykonana z PMMA , wcześniej używano szkła. Odległość między płytą przednią a tylną można regulować za pomocą podkładek dystansowych i zwykle wynosi ona od 0,1 do 0,5 mm. Płyta czołowa zawiera również wloty na bufory rozdzielające i próbkę, wyloty na rurki frakcjonujące i druty platynowe jako elektrody. Stosując różne bufory na wielu wlotach buforów, operator jest w stanie zmienić pH, stężenie soli lub skład, a tym samym warunki separacji na całej szerokości komory. Bufory rozdzielające i próbka są podawane przez pompy perystaltyczne , aby zapewnić laminarny przepływ . Pole elektryczne o wysokim napięciu jest przykładane prostopadle do przepływu laminarnego. Anality w przepływie laminarnym można rozdzielić na podstawie gęstości ładunku i/lub punktu izoelektrycznego . Ze względu na swoją wszechstronność technika ta może wykorzystywać różne tryby elektroforezy, takie jak na przykład izotachoforeza, ogniskowanie izoelektryczne lub elektroforeza strefowa (interwałowa).

Na końcu celi separacyjnej oddzielona próbka jest rozdzielana w probówkach frakcjonujących i zbierana na płytkach do mikromiareczkowania.

Schematyczna funkcjonalność elektroforezy swobodnego przepływu

Następnie próbki można scharakteryzować wszystkimi głównymi technikami, takimi jak HPLC , LC-MS , spektrometria mas ( ESI / MALDI , w zależności od zastosowanego protokołu) lub elektroforeza (IEF/ SDS PAGE , 2D-PAGE ).

Aplikacje

Standardowe zastosowania obejmują rozdzielanie w wysokiej rozdzielczości kompleksów białkowych, białek błonowych, izoform białek i przeciwciał, komórek, przedziałów subkomórkowych (takich jak organelle, rybosomy) i liposomów. Wykorzystując bardzo płaskie gradienty pH, generowane przez amfolity , możliwe jest rozdzielanie izoform białek, które różnią się o mniej niż 0,02 jednostki pH, z przepustowością około 3 mg/h. Możliwe jest również dodawanie do buforów dodatków zwiększających rozdzielczość lub denaturujących próbki. Typowe stężenia mocznika do 8M, 0,1-1% detergentów takich jak: CHAPS, CHAPSO, Digitonina, Dodecylo-ß-D-maltozyd, Octylo-ß-D-glukozyd, Triton-X-114 (IEF) i DTT do 50 mM są tolerowane.

Kluczowe cechy

Separacja bez matrycy, idealna do zachowania aktywności białek/kompleksów białkowych
Rozdzielanie w wysokiej rozdzielczości kompleksów białkowych, białek błonowych, izoform białek, komórek, przedziałów subkomórkowych (takich jak organelle, rybosomy itp.),
Zakres wielkości separacji od jonów do całych komórek
Odzysk próbki do 99%, w zależności od próbki i trybu pracy
Wysoka powtarzalność poszczególnych przebiegów
Separacja w kilka minut
Protokoły separacji metodą ogniskowania izoelektrycznego z różnymi komercyjnymi amfolitami i nietoksycznymi drobnocząsteczkowymi ProLytesTM do bezpośredniego zastosowania klinicznego
Szybkie i czułe wykrywanie jakości separacji za pomocą żeli UV, IEF
Kompatybilny z wieloma innymi technikami downstream, np. HPLC, MS, SDS-, IEF- i 2D-GE
Nadaje się do separacji niestabilnych białek dzięki chłodzeniu próbek i komory separacyjnej do 4°C
Zmniejszenie złożoności proteomu przed dalszą analizą proteomiczną
Wzbogacanie mało występujących białek poprzez usuwanie nadmiaru niepożądanych białek
Kompatybilny z dużymi i małymi próbkami o objętości od około 50 µL do kilku mililitrów.
Preparatywne i analityczne tryby działania
Obsługuje wszystkie tryby separacji elektroforetycznej (IEF, IZE, ZE, ITP)
Może być uruchamiany w warunkach natywnych lub denaturujących

Linki zewnętrzne