Etykieta powinowactwa

Znaczniki powinowactwa to klasa inhibitorów enzymów , które kowalencyjnie wiążą się z celem, powodując jego inaktywację. Cechą charakterystyczną znacznika powinowactwa jest zastosowanie ugrupowania kierującego do specyficznego i odwracalnego dostarczania słabo reaktywnej grupy do enzymu, który nieodwracalnie wiąże się z resztą aminokwasową. Kierująca część znacznika często przypomina naturalny substrat enzymu, tak że podobny sposób wiązania niekowalencyjnego jest stosowany przed wiązaniem kowalencyjnym. Ich przydatność w medycynie może być ograniczona przez specyficzność pierwszego etapu wiązania niekowalencyjnego, podczas gdy działanie masowe można wykorzystać do celów takich jak znakowanie powinowactwa - technika walidacji wiązania związków do substratu.

Te znaczniki nie ograniczają się do enzymów, ale mogą być również zaprojektowane do reagowania z przeciwciałami lub rybozymami , chociaż takie użycie jest mniej powszechne. Chociaż białka, takie jak hemoglobina, nie mają miejsca aktywnego, kieszenie wiążące można wykorzystać ze względu na ich powinowactwo, a tym samym można je oznaczyć.

Klasyfikacje

Etykiety powinowactwa można podzielić na trzy odrębne kategorie w oparciu o ich reaktywne grupy i sposób dostarczania.

Klasyczne etykiety powinowactwa

Ta kategoria obejmuje najprostsze podejście sprzęgania elektrofilu o niskiej wewnętrznej reaktywności z niekowalencyjnym ugrupowaniem wiążącym, które często naśladuje naturalny substrat. Kluczem do tego oznaczenia jest to, że reaktywność elektrofilu nie jest zmieniana przez enzym i że niekowalencyjne ugrupowanie wiążące służy do zwiększenia obecności i czasu życia elektrofilu w miejscu aktywnym (efektywna molarność ). Słabo reaktywna grupa może reagować z grupami funkcyjnymi poza miejscem aktywnym lub z innymi białkami, ale selektywność jest nadawana przez niekowalencyjne ugrupowanie wiążące. Sygnatury kinetyczne tego typu inhibitora można znaleźć w nasyceniu, ponieważ reakcja kowalencyjna (kinact) staje się etapem ograniczającym szybkość przy wysokich stężeniach inhibitora. kilka leków, takich jak afatynib , uzyskało aprobatę FDA. Zbadano również odwrotne podejście polegające na użyciu słabo nukleofilowego inhibitora do zaatakowania elektrofilu związanego z białkiem. Podejściu temu poświęcono znacznie mniej uwagi ze względu na brak elektrofilów białkowych i tylko te z odpowiednimi kofaktorami mogą być celem.

Nieaktywne etykiety powinowactwa

Spoczynkowe znaczniki powinowactwa stanowią obiecujące podejście do hamowania enzymów przy użyciu „zamaskowanych” reaktywnych funkcji, które są odkryte jedynie w miejscu aktywnym. Podejście to różni się od inaktywatorów opartych na mechanizmach tym, że kataliza musi być „poza szlakiem”. Jednym z najlepszych przykładów wyjaśniających tę formę katalizy jest inaktywacja dimetyloaminohydrolazy dimetyloarginy (DDAH) przez 4-halopirydyny. W fizjologicznym pH grupa 4-halogenowa ma prawie znikomą reaktywność z tiolanami, ale po protonowaniu azotu reaktywność wzrasta ~ 4500-krotnie. Ta protonacja zachodzi poza szlakiem przez resztę asparaginianu, która normalnie nie bierze udziału w katalizie. Po ataku cysteiny w miejscu aktywnym i utracie halogenku enzym ulega nieodwracalnej modyfikacji. Ten wymóg katalizy dostraja selektywność modyfikacji. Ta klasa nie jest ograniczona do halopirydyn i stosowano grupy funkcyjne, w tym epoksydy i acyloksymetyloketony peptydylu. Sygnatura kinetyczna tej klasy przypomina klasyczną etykietę powinowactwa. Termin ten był wcześniej używany do opisania znaczników powinowactwa, które zawierają słabo reaktywne grupy, ale ostatnio rozpoczęto literaturę dotyczącą wymogu katalizy poza szlakiem.

Etykiety fotopowinowactwa

Znaczniki fotopowinowactwa charakteryzują się nieenzymatyczną reaktywnością wytwarzaną przez ekspozycję na światło i niekowalencyjne ugrupowanie kierujące w celu zwiększenia efektywnej molarności tej reaktywnej grupy w miejscu aktywnym. Chociaż w teorii ta technika wydaje się rozsądna, często obserwuje się niski stopień znakowania, głównie z powodu gaszenia reaktywnych form przez rozpuszczalnik lub inne substancje w roztworze. Jednak to wygaszanie może być korzystne, ponieważ jest to tak szybki proces, że po utworzeniu reaktywnego ugrupowania nie będzie ono dyfundować w zauważalnym stopniu i będzie reagować tylko z cząsteczkami, z którymi bezpośrednio sąsiaduje.

Znaczniki fotopowinowactwa nie dają wielkich nadziei na hamowanie lub stosowanie leków, ale są odpowiednio przystosowane do identyfikacji miejsc wiązania liganda. Grupy reaktywne, takie jak nitreny lub 2-arylo-5-karboksytetrazole, są często wykorzystywane do wytwarzania odpowiednio wysoce reaktywnych, nieselektywnych karbenów lub umiarkowanie selektywnych związków pośrednich nitrylo-iminy.

Zastosowania etykietowania powinowactwa

Podczas charakteryzowania enzymu niezbędne jest zidentyfikowanie reszt aminokwasowych odpowiedzialnych za katalizę. Chociaż jest oczywiste, że krystalografia rentgenowska dostarczy bardziej szczegółowych trójwymiarowych informacji o miejscu aktywnym, zwracany jest tylko statyczny obraz i można napotkać trudności z kokrystalizacją substratu lub mimetyków z powodu obrotu enzymatycznego.

Klasycznym przykładem wykorzystania do tego celu znaczników powinowactwa jest mapowanie topografii miejsca aktywnego chymotrypsyny. Dzięki zastosowaniu trzech różnych znaczników powinowactwa, które umieszczały grupy reaktywne (ketony halometylowe lub fosfofluorki) w różnych regionach naturalnego rdzenia substratu, można było określić względne pozycje i tożsamość trzech różnych aminokwasów. Innym godnym uwagi przykładem zastosowania znakowania powinowactwa do określenia miejsca aktywnego enzymu jest praca przeprowadzona przez Grachev i in. co zaowocowało scharakteryzowaniem podjednostki β rdzeniowej polimerazy RNA jako podjednostki odpowiedzialnej za tworzenie wiązania fosfodiestrowego w procesie transkrypcji prokariotycznej.

Profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP)

Podstawową jednostką proteomiki opartej na aktywności jest sonda, która zazwyczaj składa się z dwóch elementów: grupy reaktywnej (RG, czasami nazywanej „głowicą”) i znacznika. Dodatkowo niektóre sondy mogą zawierać grupę wiążącą, która zwiększa selektywność. Grupa reaktywna zwykle zawiera specjalnie zaprojektowany elektrofil, który zostaje kowalencyjnie połączony z resztą nukleofilową w miejscu aktywnym aktywnego enzymu. Enzym, który jest hamowany lub zmodyfikowany posttranslacyjnie, nie będzie reagował z sondą opartą na aktywności. Znacznik może być albo reporterem, takim jak fluorofor, albo znacznikiem powinowactwa, takim jak biotyna, alkin lub azydek do stosowania z 1,3-dipolarną cykloaddycją Huisgena (znaną również jako chemia kliknięć).

Zobacz też

• Zahamowanie samobójstwa