HaloTag
HaloTag to samoznaczący się znacznik białkowy. Jest to białko o 297 resztach (33 kDa) pochodzące z enzymu bakteryjnego , przeznaczone do kowalencyjnego wiązania z syntetycznym ligandem. Enzym bakteryjny można łączyć z różnymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Syntetyczny ligand wybiera się spośród wielu dostępnych ligandów zgodnie z rodzajem przeprowadzanych doświadczeń. Ten bakteryjny enzym to dehalogenaza haloalkanowa , która działa jak hydrolaza i jest zaprojektowany w celu ułatwienia wizualizacji subkomórkowej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, immobilizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania lub wychwytywania partnerów wiążących białka będącego przedmiotem zainteresowania w jego środowisku biochemicznym. HaloTag składa się z dwóch kowalencyjnie związanych segmentów, w tym dehalogenazy haloalkanowej i syntetycznego ligandu z wyboru. Te syntetyczne ligandy składają się z reaktywnego łącznika chloroalkanowego związanego z grupą funkcyjną. Grupy funkcyjne mogą być albo biotyną (może być stosowana jako znacznik powinowactwa) albo mogą być wybrane spośród pięciu dostępnych barwników fluorescencyjnych, w tym Coumarin, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM i TMR. Te barwniki fluorescencyjne można stosować do wizualizacji żywych lub chemicznie utrwalonych komórek.
Mechanizm
HaloTag jest hydrolazą, która ma genetycznie zmodyfikowane miejsce aktywne, które specyficznie wiąże reaktywny linker chloroalkanowy i ma zwiększoną szybkość wiązania ligandu. Reakcja, która tworzy wiązanie między znacznikiem białkowym a łącznikiem chloroalkanowym, jest szybka i zasadniczo nieodwracalna w warunkach fizjologicznych ze względu na końcowy chlor części łącznika. We wspomnianej reakcji atak nukleofilowy reaktywnego łącznika chloroalkanowego powoduje wyparcie halogenu na resztę aminokwasową, co skutkuje powstaniem kowalencyjnego alkilo-enzymu pośredniego. Ten związek pośredni byłby następnie hydrolizowany przez resztę aminokwasową hydrolazy typu dzikiego. Prowadziłoby to do regeneracji enzymu po reakcji. Jednak w zmodyfikowanej dehalogenazie haloalkanowej (HaloTag) związek pośredni reakcji nie może przejść przez kolejną reakcję, ponieważ nie może być hydrolizowany z powodu mutacji w enzymie. Powoduje to, że związek pośredni utrzymuje się jako stabilny addukt kowalencyjny, z którym nie wiąże się reakcja zwrotna.
Używa
Białka fuzyjne HaloTagged można wyrażać przy użyciu standardowych technik ekspresji białek rekombinowanych . Ponadto istnieje kilka wektorów komercyjnych dostępne, które wymagają jedynie wstawienia genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponieważ dehalogenazy bakteryjne są stosunkowo małe, a reakcje opisane powyżej są obce komórkom ssaków, endogenne reakcje metaboliczne ssaków nie wpływają na nie. Po ekspresji białka fuzyjnego istnieje szeroki zakres potencjalnych obszarów eksperymentów, w tym testy enzymatyczne, obrazowanie komórkowe, macierze białkowe, określanie lokalizacji subkomórkowej i wiele dodatkowych możliwości.
Niedawno HaloTag został zaprojektowany do tworzenia hybrydowych biosensorów białkowych i małocząsteczkowych aktywności neuronów. Czujniki te ulegają zmianie konformacyjnej w odpowiedzi na skoki stężenia wapnia podczas odpalania neuronów; ta zmiana konformacyjna moduluje konformację cząsteczki barwnika związanej z HaloTag.