Znacznik SNAP
SNAP-tag® jest samoznakującym się znacznikiem białkowym dostępnym w handlu w różnych wektorach ekspresyjnych. Znacznik SNAP jest polipeptydem o 182 resztach (19,4 kDa), który można połączyć z dowolnym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, a ponadto specyficznie i kowalencyjnie oznaczyć odpowiednim ligandem, takim jak barwnik fluorescencyjny . Od momentu wprowadzenia SNAP-tag znalazł liczne zastosowania w biochemii oraz do badania funkcji i lokalizacji białek i enzymów w żywych komórkach. W porównaniu z obecnymi standardowymi metodami znakowania stosowanymi w mikroskopii fluorescencyjnej [ określić ] , użycie znacznika SNAP przedstawia znaczące korzyści [ potrzebne źródło ] . SNAP-tag® jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy New England Biolabs, Inc.
Aplikacje
Biologia komórki wykorzystuje narzędzia, które umożliwiają manipulację i wizualizację białek w żywych komórkach. Ważnym przykładem jest zastosowanie białek fluorescencyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP) lub żółte białko fluorescencyjne (YFP). Metody biologii molekularnej umożliwiają wprowadzenie tych białek fluorescencyjnych i ich ekspresję w żywych komórkach jako białka fuzyjne. Jednak właściwości fotofizyczne białek fluorescencyjnych generalnie nie nadają się do spektroskopii pojedynczych cząsteczek. Białka fluorescencyjne mają, w porównaniu z komercyjnie dostępnymi barwnikami, znacznie niższą wydajność kwantową fluorescencji i są szybko niszczone po wzbudzeniu zogniskowaną wiązką laserową (fotowybielanie).
Białko SNAP-tag® jest zmodyfikowaną wersją powszechnie występującego u ssaków enzymu AGT, kodowanego u ludzi przez gen metylotransferazy DNA O-6-metyloguaniny (MGMT). Znacznik SNAP uzyskano stosując strategię ukierunkowanej ewolucji, co doprowadziło do wariantu hAGT, który akceptuje O6 - benzyloguaniny zamiast naprawy alkilowanych pochodnych guaniny w uszkodzonym DNA.
Znacznik ortogonalny, nazwany CLIP-tag™, został następnie zmodyfikowany ze znacznika SNAP, aby przyjmować pochodne O2 - benzylocytozyny jako substraty zamiast O6 - benzyloguaniny. Dlatego białka fuzyjne Clip-tag- i SNAP-tag-tag mogą być znakowane jednocześnie w tych samych komórkach. Później opracowano wersję split-SNAP-tag odpowiednią do testu komplementacji białek i badań interakcji białko-białko.
Oprócz mikroskopii fluorescencyjnej , SNAP-tag i CLIP-tag okazały się przydatne w wyjaśnianiu wielu procesów biologicznych, w tym identyfikacji kompleksów wielobiałkowych przy użyciu różnych podejść, takich jak FRET , sieciowanie, test ligacji bliskości , a także oczyszczanie granulek wydzielniczych insuliny w różnym wieku poprzez przeprowadzanie eksperymentów z pościgiem pulsacyjnym. Inne zastosowania obejmują pomiar okresu półtrwania białek in vivo oraz interakcje między małymi cząsteczkami i białkami. SNAP-tag® jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy New England Biolabs, Inc. CLIP-tag™ jest znakiem towarowym firmy New England Biolabs, Inc.
Zobacz też
Dalsza lektura
- Kepplera A; Kindermann M; Gendreizig S; Wybierz H; Vogel H.; Johnsson K. (2004). „Znakowanie białek fuzyjnych alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA małymi cząsteczkami in vivo i in vitro”. Metody . 32 (4): 437–444. doi : 10.1016/j.ymet.2003.10.007 . PMID 15003606 .
- Kepplera A; Wybierz H; Arrivoli C; Vogel H.; Johnsson K. (2004). „Znakowanie białek fuzyjnych syntetycznymi fluoroforami w żywych komórkach” . proc. Natl. Acad. nauka USA . 101 (27): 9955–9959. Bibcode : 2004PNAS..101.9955K . doi : 10.1073/pnas.0401923101 . PMC454197 . _ PMID 15226507 .
- Juillerat A; Heinis C; Sielaff I; Barnikow J; Żakard H.; Kunza B; Terskikh A; Johnsson K. (2005). „Inżynieria specyficzności substratowej alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA do specyficznego znakowania białek w żywych komórkach”. ChemBioChem . 6 (7): 1263–1269. doi : 10.1002/cbic.200400431 . PMID 15934048 . S2CID 23926764 .
Linki zewnętrzne
- Darstellung SNAP-Tag i CLIP-Tag (NEB)
- Samooznaczające się znaczniki białkowe. W: Bioforum. Jg. 2005, nr. 6, s. 50-51.