Rezonansowy transfer energii Förstera

Diagram Jabłońskiego FRET z zaznaczonymi typowymi skalami czasowymi. Zauważ, że czarna przerywana linia wskazuje wirtualny foton .

Rezonansowy transfer energii Förstera ( FRET ), rezonansowy transfer energii fluorescencji, rezonansowy transfer energii ( RET ) lub elektroniczny transfer energii ( EET ) to mechanizm opisujący transfer energii między dwiema światłoczułymi cząsteczkami ( chromoforami ). Chromofor donorowy, początkowo w stanie wzbudzonym elektronicznie, może przenosić energię do chromoforu akceptorowego poprzez nieradiacyjne sprzężenie dipol-dipol . Wydajność tego transferu energii jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między donorem a akceptorem, co sprawia, że ​​FRET jest niezwykle wrażliwy na niewielkie zmiany odległości.

Pomiary wydajności FRET można wykorzystać do określenia, czy dwa fluorofory znajdują się w pewnej odległości od siebie. Takie pomiary są wykorzystywane jako narzędzie badawcze w dziedzinach obejmujących biologię i chemię.

FRET jest analogiczny do komunikacji bliskiego pola , ponieważ promień interakcji jest znacznie mniejszy niż długość fali emitowanego światła. W obszarze pola bliskiego wzbudzony chromofor emituje wirtualny foton , który jest natychmiast absorbowany przez chromofor odbiorczy. Te wirtualne fotony są niewykrywalne, ponieważ ich istnienie narusza zasadę zachowania energii i pędu, dlatego FRET jest znany jako bezpromienisty . Kwantowe obliczenia elektrodynamiczne zostały wykorzystane do określenia bezpromieniowego (FRET) i radiacyjnego przenoszenia energii asymptotami krótkiego i dalekiego zasięgu pojedynczego zunifikowanego mechanizmu.

Terminologia

Schemat rysunkowy koncepcji rezonansowego transferu energii Förstera (FRET).

Rezonansowy transfer energii Förstera został nazwany na cześć niemieckiego naukowca Theodora Förstera . Kiedy oba chromofory są fluorescencyjne, zamiast tego często używany jest termin „rezonansowy transfer energii fluorescencji”, chociaż energia nie jest w rzeczywistości przenoszona przez fluorescencję . Aby uniknąć błędnej interpretacji zjawiska, które jest zawsze niepromienistym przenoszeniem energii (nawet jeśli występuje między dwoma chromoforami fluorescencyjnymi), preferowana jest nazwa „rezonansowy transfer energii Förstera” zamiast „rezonansowy transfer energii fluorescencji”; jednak ten ostatni cieszy się powszechnym użyciem w literaturze naukowej. FRET nie ogranicza się do fluorescencji i występuje również w połączeniu z fosforescencją.

Podstawy teoretyczne

Wydajność FRET ( ) to wydajność kwantowa przejścia transferu energii, tj. Prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia transferu energii na zdarzenie wzbudzenia dawcy: mi {\ $E}$

${\ Displaystyle E = {\ Frac {k _ {\ tekst {ET}}} {k_ {f} + k _ {\ tekst {ET}} + \ suma { k_{i}}}},}$

gdzie ${\ displaystyle k _ {\ tekst {ET}}}$ to szybkość transferu energii, ${\ displaystyle k_ {f}}$ szybkość rozpadu promieniowania dawcy i ${\ displaystyle k_ {i} }$ szybkości wszelkich innych dróg odwzbudzenia z wyłączeniem transferów energii do innych akceptorów.

Wydajność FRET zależy od wielu parametrów fizycznych, które można pogrupować jako: 1) odległość między donorem a akceptorem (zwykle w zakresie 1–10 nm), 2) nakładanie się widma widma emisyjnego donora i absorpcji akceptora widmo i 3) względna orientacja momentu dipolowego emisji donora i momentu dipolowego absorpcji akceptora.

${\ displaystyle E} zależy od$$displaystyle E}$ separacji dawcy od akceptora z odwrotnym prawem szóstej potęgi ze względu na mechanizm sprzężenia dipol-dipol: mi {\

${\ Displaystyle E = {\ Frac {1} {1 + (r / R_ {0}) ^ {6}}}}$

gdzie ${\ displaystyle R_ {0}}$ jest odległością Förstera tej pary dawcy i akceptora, tj. odległością, przy której efektywność transferu energii wynosi 50%. Odległość Förstera zależy od całki nakładania się widma emisyjnego donora z widmem absorpcyjnym akceptora i ich wzajemnej orientacji cząsteczkowej, wyrażonej następującym równaniem, wszystko w jednostkach SI:

${\ Displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = {\ Frac {20,7} {128 \, \ pi ^ {5} \, N_ { A}}}\,{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$

gdzie $jest$ wydajnością kwantową fluorescencji dawcy pod nieobecność akceptora $współczynnikiem$ , $displaystyle n}$${$$}$ to współczynnik załamania światła ośrodka, to stała Avogadro , a to całka nakładania się widma obliczona jako: ${\ displaystyle N _ {\ tekst {A}}$

${\ Displaystyle J = {\ Frac {\ int f _ {\ tekst {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ tekst {A}} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}} \int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A }}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}$

gdzie ${D}}} jest$$widmem$ emisyjnym dawcy, widmem emisyjnym dawcy znormalizowanym do obszar 1, a $zwykle$ molowym współczynnikiem ekstynkcji uzyskiwanym z widma absorpcji. Współczynnik orientacji κ jest określony wzorem

${\ Displaystyle \ kappa = {\ kapelusz {\ mu}} _ {\ tekst {A}} \cdot {\kapelusz {\mu}}_{\tekst{D}}-3({\kapelusz {\mu}}_{\tekst{D}}\cdot {\kapelusz {R}})({\ kapelusz {\mu}}_{\tekst{A}}\cdot {\kapelusz {R}}),}$

gdzie oznacza znormalizowany $moment$$oznacza$ odpowiedniego fluoroforu, wypieranie fluoroforu. Często przyjmuje się, że ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$ = 2/3. Wartość tę uzyskuje się, gdy oba barwniki swobodnie się obracają i można uznać, że są zorientowane izotropowo podczas życia w stanie wzbudzonym. Jeśli którykolwiek barwnik jest nieruchomy lub nie może się swobodnie obracać, wówczas ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ = 2/3 nie będzie prawidłowym założeniem. Jednak w większości przypadków nawet niewielka reorientacja barwników skutkuje wystarczającym uśrednieniem orientacji, że = 2/3 nie powoduje dużego błędu w szacowanej odległości przenoszenia energii z powodu ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}}$ zależność od szóstej potęgi $displaystyle$ κ $\ kappa ^ {2}}$ . Nawet gdy jest zupełnie inny niż 2/3, błąd można powiązać z przesunięciem ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle R_ {0}}$ , a zatem określenia zmian względnej odległości dla konkretnego systemu są nadal aktualne. Białka fluorescencyjne nie zmieniają orientacji w skali czasu, która jest szybsza niż ich czas życia fluorescencji. W tym przypadku 0 ≤ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ≤ 4.

Jednostki danych zwykle nie są w jednostkach SI. Używanie oryginalnych jednostek do obliczania odległości Förstera jest często wygodniejsze. Na przykład długość fali jest często w jednostce nm, a współczynnik ekstynkcji jest często w jednostce, gdzie jest $-1} cm ^ {-1}}$$Displaystyle M ^$ stężenie ${\ Displaystyle mol / L}$ . uzyskane z tych jednostek będą miały jednostkę ${\ displaystyle J}$${\ Displaystyle M ^ {- 1} cm ^ {- 1} nm ^ {4}}$ . Aby użyć jednostki Å ( ${\ Displaystyle 10 ^ {-10} m}$ ​​) dla , równanie jest dostosowywane do ${\ Displaystyle R_ {0}}$

${\ Displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = 8,785 \ razy 10 ^ {- 5} {\ Frac {\ kappa ^ {2} \, Q_ {D} {n ^ {4}}} J}$ (Å ${\ Displaystyle ^ {6}}$ )

zamiast tego można bezpośrednio użyć szybkości transferu energii ( ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}: k ET {\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$

${\ Displaystyle k _ {\ tekst {ET}} = ({\ Frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} \, {\ Frac {1} {\tau _{D}}}}$

gdzie $.$ czasem życia fluorescencji dawcy pod nieobecność

Wydajność FRET odnosi się do wydajności kwantowej i czasu życia fluorescencji cząsteczki dawcy w następujący sposób:

${\ Displaystyle E = 1 - \ tau '_ {\ tekst {D}} / \ tau _ {\ tekst {D}},}$

gdzie ${\ Displaystyle \ tau _ {\ tekst {D}} '}$$i$ są i nieobecności akceptora lub jako

${\ Displaystyle E = 1-F _ {\ tekst {D}} '/ F _ {\ tekst {D}},}$

gdzie i $są$$.$ dawcy odpowiednio z akceptorem

Eksperymentalne potwierdzenie teorii przenoszenia energii rezonansu Förstera

Wilchek , Edelhoch i Brand przy użyciu peptydów tryptofilowych potwierdzili eksperymentalnie odwrotną zależność odległości od szóstej potęgi transferu energii rezonansu Förstera . Stryer , Haugland i Yguerabide również eksperymentalnie wykazali teoretyczną zależność przenoszenia energii rezonansu Förstera od całki nakładania się, używając skondensowanego indolosteroidu jako donora i ketonu jako akceptora. Obliczenia dotyczące odległości FRET niektórych przykładowych par barwników można znaleźć tutaj. Jednak wiele sprzeczności specjalnych eksperymentów z teorią zaobserwowano w skomplikowanym środowisku, gdy orientacje i wydajności kwantowe cząsteczek są trudne do oszacowania.

Metody pomiaru efektywności FRET

W mikroskopii fluorescencyjnej , fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej , a także w biologii molekularnej , FRET jest użytecznym narzędziem do ilościowego określania dynamiki molekularnej w biofizyce i biochemii , takiej jak interakcje białko -białko, białko- DNA interakcje i zmiany konformacyjne białek. W celu monitorowania tworzenia kompleksu między dwiema cząsteczkami, jedna z nich jest oznaczona donorem, a druga akceptorem. Wydajność FRET jest mierzona i wykorzystywana do identyfikacji interakcji między znakowanymi kompleksami. Istnieje kilka sposobów mierzenia wydajności FRET poprzez monitorowanie zmian fluorescencji emitowanej przez dawcę lub akceptora.

Emisja uczulona

Jedną z metod pomiaru wydajności FRET jest pomiar zmiany intensywności emisji akceptora. Kiedy donor i akceptor znajdują się w pobliżu (1–10 nm) z powodu interakcji dwóch cząsteczek, emisja akceptora wzrośnie z powodu międzycząsteczkowego FRET od dawcy do akceptora. W celu monitorowania zmian konformacyjnych białka docelowe białko jest znakowane donorem i akceptorem w dwóch loci. Kiedy skręcenie lub zgięcie białka powoduje zmianę odległości lub względnej orientacji dawcy i akceptora, obserwuje się zmianę FRET. Jeśli interakcja molekularna lub zmiana konformacji białka zależy od ligandu wiązanie, ta technika FRET ma zastosowanie do wskaźników fluorescencyjnych do wykrywania ligandów.

Fotowybielanie FRET

Wydajność FRET można również wywnioskować z szybkości fotowybielania dawcy w obecności i nieobecności akceptora. Metodę tę można wykonać na większości mikroskopów fluorescencyjnych; po prostu świeci światłem wzbudzenia (o częstotliwości, która pobudzi dawcę, ale nie akceptora znacząco) na próbki z fluoroforem akceptorowym i bez niego i monitoruje fluorescencję dawcy (zwykle oddzieloną od fluorescencji akceptora za pomocą filtra pasmowoprzepustowego) w czasie . Skala czasowa to fotowybielanie, która wynosi od sekund do minut, przy czym fluorescencja na każdej krzywej jest określona przez

${\ Displaystyle {\ tekst {tło}} + {\ tekst {stała}} \ cdot e ^ {- {\ tekst {czas}} / \ tau _ {\ tekst { pb}}},}$

gdzie jest stałą czasową rozpadu fotowybielania i zależy od tego, czy akceptor jest obecny, $czy$ Ponieważ fotowybielanie polega na trwałej inaktywacji wzbudzonych fluoroforów, transfer energii rezonansowej ze wzbudzonego dawcy do akceptorowego fluoroforu zapobiega fotowybielaniu tego donorowego fluoroforu, a zatem wysoka wydajność FRET prowadzi do dłuższej stałej czasowej rozpadu fotowybielania:

${\ Displaystyle E = 1 - \ tau _ {\ tekst {pb}}/\ tau _ {\ tekst {pb}} ',}$

gdzie $i$ są $obecności$ dawcy w nieobecności akceptanta. (Zauważ, że ułamek jest odwrotnością ułamka używanego do pomiarów czasu życia).

Ta technika została wprowadzona przez Jovina w 1989 roku. Wykorzystanie całej krzywej punktów do wyodrębnienia stałych czasowych może zapewnić jej przewagę dokładności nad innymi metodami. Ponadto fakt, że pomiary czasu trwają ponad sekundy, a nie nanosekundy, czyni to łatwiejszym niż pomiary czasu życia fluorescencji, a ponieważ szybkości zaniku fotowybielania generalnie nie zależą od stężenia dawcy (chyba że problemem jest nasycenie akceptora), dokładna kontrola stężeń potrzebnych do intensywności pomiary nie są potrzebne. Ważne jest jednak, aby oświetlenie było takie samo dla pomiarów z akceptorem i bez, ponieważ fotowybielanie znacznie wzrasta wraz z intensywniejszym padającym światłem.

Pomiary żywotności

Wydajność FRET można również określić na podstawie zmiany czasu życia fluorescencji dawcy. Życie dawcy skróci się w obecności akceptora. Pomiary czasu życia dawcy FRET są wykorzystywane w mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM).

Jednocząsteczkowy FRET (smFRET)

Główny artykuł jednocząsteczkowy FRET .

smFRET to grupa metod wykorzystujących różne techniki mikroskopowe do pomiaru pary fluoroforów donorowych i akceptorowych, które są wzbudzane i wykrywane na poziomie pojedynczej cząsteczki. W przeciwieństwie do „zespołu FRET” lub „masowego FRET”, który zapewnia sygnał FRET dużej liczby cząsteczek, FRET pojedynczej cząsteczki jest w stanie rozdzielić sygnał FRET każdej pojedynczej cząsteczki. Zmiana sygnału smFRET jest przydatna do ujawnienia informacji kinetycznych, których nie może dostarczyć pomiar zespołowy, zwłaszcza gdy system jest w równowadze. Można również zaobserwować heterogeniczność między różnymi cząsteczkami. Metodę tę zastosowano w wielu pomiarach dynamiki biomolekularnej, takich jak fałdowanie/rozwijanie DNA/RNA/białek i innych zmian konformacyjnych, a także w dynamice międzycząsteczkowej, takiej jak reakcja, wiązanie, adsorpcja i desorpcja, które są szczególnie przydatne w wykrywaniu chemicznym, testach biologicznych i bioczujniki.

Fluorofory używane do FRET

Jeśli łącznik jest nienaruszony, wzbudzenie przy długości fali absorbancji CFP (414 nm) powoduje emisję YFP (525 nm) z powodu FRET. Jeśli łącznik jest rozszczepiany przez proteazę, FRET zostaje zniesiony, a emisja odbywa się na długości fali CFP (475 nm).

Pary CFP-YFP

Jedną z powszechnych par fluoroforów do zastosowań biologicznych jest para cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) - żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Oba są wariantami kolorystycznymi zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Znakowanie organicznymi barwnikami fluorescencyjnymi wymaga oczyszczenia, modyfikacji chemicznej i wewnątrzkomórkowego wstrzyknięcia białka gospodarza. Warianty GFP można dołączyć do białka gospodarza za pomocą inżynierii genetycznej , co może być wygodniejsze. Dodatkowo, fuzję CFP i YFP („tandem-dimer”) połączonych przez proteazą można zastosować jako test cięcia.

BRET

Ograniczeniem FRET wykonywanego z donorami fluoroforów jest konieczność zewnętrznego oświetlenia w celu zainicjowania transferu fluorescencji, co może prowadzić do szumu tła w wynikach z bezpośredniego wzbudzenia akceptora lub fotowybielania . Aby uniknąć tej wady, opracowano rezonansowy transfer energii bioluminescencji (lub BRET ). Ta technika wykorzystuje bioluminescencyjną lucyferazę (zwykle lucyferazę z Renilla reniformis ) zamiast CFP do wytworzenia początkowej emisji fotonów zgodnej z YFP.

BRET został również wdrożony przy użyciu innego enzymu lucyferazy, opracowanego z krewetki głębinowej Oplophorus gracilirostris . Ta lucyferaza jest mniejsza (19 kD) i jaśniejsza niż powszechnie stosowana lucyferaza z Renilla reniformis i została nazwana NanoLuc lub NanoKAZ. Firma Promega opracowała opatentowany substrat dla NanoLuc zwany furimazyną, chociaż opublikowano również inne cenne substraty koelenterazyny dla NanoLuc. Wersja NanoLuc z rozszczepionym białkiem została opracowana przez firmę Promega i była również wykorzystywana jako donor BRET w eksperymentach mierzących interakcje białko-białko

Homo-FRET

Ogólnie „FRET” odnosi się do sytuacji, w których białka donorowe i akceptorowe (lub „fluorofory”) są dwóch różnych typów. Jednak w wielu sytuacjach biologicznych badacze mogą potrzebować zbadać interakcje między dwoma lub więcej białkami tego samego typu – lub w rzeczywistości tym samym białkiem ze sobą, na przykład, jeśli białko fałduje się lub tworzy część łańcucha polimeru białek lub w przypadku innych pytań dotyczących oznaczania ilościowego w komórkach biologicznych.

Oczywiście różnice widmowe nie będą narzędziem używanym do wykrywania i pomiaru FRET, ponieważ zarówno białko akceptorowe, jak i donorowe emitują światło o tych samych długościach fal. Jednak naukowcy mogą wykryć różnice w polaryzacji między światłem, które wzbudza fluorofory, a światłem, które jest emitowane, w technice zwanej obrazowaniem anizotropii FRET; poziom ilościowej anizotropii (różnica w polaryzacji między wiązkami wzbudzenia i emisji) staje się wówczas orientacyjnym przewodnikiem po liczbie zdarzeń FRET.

Inni

Różne związki poza białkami fluorescencyjnymi.

Aplikacje

Zastosowania transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) ogromnie się rozszerzyły w ciągu ostatnich 25 lat, a technika ta stała się podstawą wielu dziedzin biologicznych i biofizycznych . FRET może być używany jako linijka spektroskopowa do pomiaru odległości i wykrywania interakcji molekularnych w wielu systemach i ma zastosowania w biologii i biochemii.

Białka

FRET jest często używany do wykrywania i śledzenia interakcji między białkami. Dodatkowo FRET można wykorzystać do pomiaru odległości między domenami w pojedynczym białku poprzez znakowanie różnych regionów białka fluoroforami i pomiar emisji w celu określenia odległości. Dostarcza to informacji na temat konformacji białek , w tym struktur drugorzędowych i fałdowania białek . Obejmuje to śledzenie zmian funkcjonalnych w strukturze białek, takich jak zmiany konformacyjne związane z miozyną działalność. Zastosowany in vivo FRET został wykorzystany do wykrywania lokalizacji i interakcji struktur komórkowych, w tym integryn i białek błonowych .

Membrany

FRET może być używany do obserwacji płynności błony komórkowej , ruchu i dyspersji białek błonowych, oddziaływań lipid-białko błony i białko-białko oraz udanego mieszania różnych błon. FRET jest również używany do badania powstawania i właściwości domen błonowych i tratw lipidowych w błonach komórkowych oraz do określania gęstości powierzchniowej w błonach.

Chemosensoryczne

Sonda oparta na FRET, która aktywuje się po interakcji z Cd2+

Sondy oparte na FRET mogą wykrywać obecność różnych cząsteczek: na strukturę sondy wpływa wiązanie lub aktywność małych cząsteczek, co może włączać lub wyłączać system FRET. Jest to często używane do wykrywania anionów, kationów, małych nienaładowanych cząsteczek, a także niektórych większych biomakromolekuł. Podobnie systemy FRET zostały zaprojektowane do wykrywania zmian w środowisku komórkowym pod wpływem takich czynników jak pH , niedotlenienie czy potencjał błony mitochondrialnej .

Szlaki sygnalizacyjne

Innym zastosowaniem FRET jest badanie szlaków metabolicznych lub sygnalizacyjnych . Na przykład FRET i BRET zastosowano w różnych eksperymentach do scharakteryzowania receptora sprzężonego z białkiem G i wynikających z tego mechanizmów sygnalizacyjnych. Inne przykłady obejmują zastosowanie FRET do analizy tak różnych procesów, jak chemotaksja bakteryjna i aktywność kaspazy w apoptozie .

Kinetyka fałdowania białek i nukleotydów

Białka, DNA, RNA i inne dynamiki fałdowania polimerów zostały zmierzone za pomocą FRET. Zwykle układy te znajdują się w równowadze, której kinetyka jest ukryta. Można je jednak zmierzyć, mierząc FRET pojedynczej cząsteczki z odpowiednim rozmieszczeniem barwników akceptorowych i donorowych na cząsteczkach. Bardziej szczegółowy opis można znaleźć w FRET pojedynczej cząsteczki .

Inne aplikacje

Oprócz wspomnianych wcześniej powszechnych zastosowań, FRET i BRET są również skuteczne w badaniu kinetyki reakcji biochemicznych. FRET jest coraz częściej używany do monitorowania składania i rozkładania zależnego od pH i jest cenny w analizie kwasów nukleinowych . Technika ta może być wykorzystana do określenia czynników wpływających na powstawanie różnych typów nanocząstek oraz mechanizmów i działania nanoleków .

Inne metody

Innym, ale powiązanym mechanizmem jest transfer elektronów Dextera .

Alternatywną metodą wykrywania bliskości białko-białko jest dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC), w której dwie części białka fluorescencyjnego są połączone z innymi białkami. Kiedy te dwie części się spotykają, tworzą fluorofor w skali czasu minut lub godzin.

Zobacz też

• Przeniesienie elektronu Dextera
• sprzęgło Förstera
• Transfer energii powierzchniowej
• Czasowo rozdzielczy transfer energii fluorescencji

Linki zewnętrzne

• na YouTubie
• Obrazowanie FRET (samouczek firmy Becker & Hickl, strona internetowa)