Czasowo rozdzielczy transfer energii fluorescencji
Czasowo-rozdzielczy transfer energii fluorescencji ( TR-FRET ) to praktyczne połączenie czasowo-rozdzielczej fluorometrii (TRF) z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET), które oferuje potężne narzędzie dla badaczy odkrywających leki. TR-FRET łączy aspekt niskiego tła TRF z jednorodnym formatem testu FRET. Uzyskany test zapewnia większą elastyczność, niezawodność i czułość, a także wyższą przepustowość i mniej wyników fałszywie dodatnich/fałszywie ujemnych. FRET obejmuje dwa fluorofory , dawcy i akceptora. Wzbudzenie donora przez źródło energii (np. lampę błyskową lub laser) powoduje przekazanie energii do akceptora, jeśli oba znajdują się w określonej odległości od siebie. Akceptor z kolei emituje światło o charakterystycznej długości fali.
00 Aspekt technologii FRET zależy od kilku czynników, w tym nakładania się widm i bliskości zaangażowanych fluoroforów, w których transfer energii zachodzi tylko wtedy, gdy odległość między dawcą a akceptorem jest wystarczająco mała. W praktyce systemy FRET charakteryzują się promieniem Förstera (R ): odległość między fluoroforami, przy której wydajność FRET wynosi 50%. Dla wielu par fluoroforów FRET R leży między 20 a 90 Å, w zależności od zastosowanego akceptora i przestrzennego rozmieszczenia fluoroforów w teście. Poprzez pomiar tego transferu energii, interakcje między biomolekuły można ocenić, łącząc każdego partnera ze znacznikiem fluorescencyjnym i wykrywając poziom transferu energii. Emisja akceptora jako miara transferu energii może być wykryta bez konieczności oddzielania związanych i niezwiązanych składników testu (np. etap filtracji lub przemywania), co skraca czas i koszt testu.
Zalety
Homogeniczne testy TR-FRET typu „mix-and-read” oferują przewagę nad innymi biomolekularnymi testami przesiewowymi, takimi jak polaryzacja fluorescencji (FP) lub testy TRF. W testach FP fluorescencja tła spowodowana związkami z biblioteki jest normalnie zdepolaryzowana, a sygnał tła spowodowany światłem rozproszonym (np. związki wytrącone) jest normalnie spolaryzowany. W zależności od konfiguracji testu, każdy przypadek może prowadzić do wyniku fałszywie dodatniego lub fałszywie ujemnego. Jednakże, ponieważ gatunek dawcy użyty w teście TR-FRET ma czas życia fluorescencji, który jest o wiele rzędów wielkości dłuższy niż fluorescencja tła lub światło rozproszone, sygnał emisji wynikający z transferu energii można zmierzyć po całkowitym zaniku sygnału zakłócającego. Testy TR-FRET można również sformatować tak, aby wykorzystywały ograniczone stężenia receptora i nadmiaru znacznika (w przeciwieństwie do testów FP), co może zapewnić dalsze oszczędności. W przypadku testów TRF wymagany jest etap przemywania w celu usunięcia niezwiązanych odczynników fluorescencyjnych przed pomiarem sygnału aktywności testu. Zwiększa to zużycie odczynników, czas do zakończenia testu i ogranicza możliwość miniaturyzacji systemu (np. 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania do 1536-dołkowej płytki ). Testy TR-FRET wykorzystują wymaganą bliskość gatunku dawcy i akceptora do generowania sygnału.
Ponadto niektórzy badacze preferują tę metodę, ponieważ nie opiera się na materiałach radioaktywnych do generowania sygnału do wykrycia. Pozwala to uniknąć zarówno zagrożeń związanych z używaniem materiałów, jak i kosztów i logistyki przechowywania, użytkowania i utylizacji.
składniki
Chociaż TR-FRET można uzyskać za pomocą różnych kombinacji fluoroforów, szczególnie przydatne są metale lantanowców. Niektóre zastosowania w naukach przyrodniczych wykorzystują unikalne właściwości fluorescencyjne kompleksów jonów lantanowców (chelaty lub kryptaty Ln(III)). Są one dobrze przystosowane do tego zastosowania ze względu na duże przesunięcia Stokesa i wyjątkowo długi czas życia emisji (od mikrosekund do milisekund) w porównaniu z bardziej tradycyjnymi fluoroforami (np. fluoresceiną, allofikojaninem, fikoerytryną i rodaminą). Płyny biologiczne lub surowica powszechnie stosowane w tych zastosowaniach badawczych zawierają wiele związków i białek, które są naturalnie fluorescencyjne. Dlatego zastosowanie konwencjonalnego pomiaru fluorescencji w stanie ustalonym wiąże się z poważnymi ograniczeniami czułości testu. Długożyciowe fluorofory, takie jak lantanowce, w połączeniu z detekcją czasowo-rozdzielczą (opóźnienie między wzbudzeniem a detekcją emisji) minimalizują szybką interferencję fluorescencji. Ta metoda (powszechnie nazywana fluorometrią czasowo-rozdzielczą lub TRF) obejmuje dwa fluorofory: donor i akceptor. Wzbudzenie fluoroforu donorowego (w tym przypadku kompleksu jonów lantanowców) przez źródło energii (np. lampę błyskową lub laser) powoduje przeniesienie energii do fluoroforu akceptorowego, jeśli znajdują się one w określonej odległości od siebie (znanej jako promień Förstera ). Z kolei fluorofor akceptorowy emituje światło o charakterystycznej długości fali. Dwa najczęściej stosowane lantanowce w testach nauk przyrodniczych pokazano poniżej wraz z odpowiadającym im barwnikiem akceptorowym, a także długościami fal wzbudzenia i emisji oraz wynikającym z tego przesunięciem Stokesa (oddzielenie długości fal wzbudzenia i emisji).
Typowe pary donor-akceptor lantanowców
| Dawca | Wzbudzenie⇒Emisja λ (nm) | Akceptor | Wzbudzenie⇒Emisja λ (nm) | Przesunięcie Stokesa (nm) (wzbudzenie donora ⇒ emisja akceptora) |
|---|---|---|---|---|
| Europ 3+ | 340 ⇒ 615 | Allofikocyjanina | 615 ⇒ 660 | 320 |
| Terb 3+ | 340 ⇒ 545 | Fikoerytryna | 545 ⇒ 575 | 235 |
Przykład TR-FRET
Jak zauważono w powyższej tabeli, transfer energii fluorescencji z europu do allofikocyjaniny można zastosować w sposób rozdzielczy w czasie, szczególnie w biomolekularnych testach przesiewowych. Rysunek po prawej pokazuje przecięcie emisji z europu ze wzbudzeniem allofikocyjaniny (APC), gdzie następuje transfer energii, gdy europ i APC zbliżają się do siebie poprzez interakcje biomolekularne.
Kiedy te dwa fluorofory zostaną połączone w wyniku interakcji biomolekularnej, część energii przechwyconej przez europ podczas wzbudzenia jest uwalniana poprzez emisję fluorescencji przy 620 nm, podczas gdy pozostała energia jest przekazywana do APC. Energia ta jest następnie uwalniana przez APC jako specyficzna fluorescencja przy 665 nm tylko przez FRET z europem.
Dzięki zaprojektowaniu wysokowydajnego testu przesiewowego materiały są mieszane, a jeśli enzym działa na peptyd, wszystkie składniki zwiążą swoje odpowiednie cele i wystąpi FRET.
Przyrząd używany do pomiaru testu następnie opóźnia odczyt emitowanego światła o kilkaset milisekund po świetle padającym/wzbudzającym (impuls energii świetlnej dostarczany przez przyrząd w celu wzbudzenia cząsteczki dawcy) w celu wyeliminowania wszelkich „przesłuchów” między sygnałami wzbudzenia i emisji. („cross-talk” w tym przypadku odnosi się do nakładających się profili widmowych, co może skutkować fałszywie dodatnimi, fałszywie ujemnymi lub zmniejszoną czułością, w zależności od projektu testu). Proces ten obejmuje aspekt „rozdzielczości czasowej” testu .