Jednocząsteczkowy FRET

Rezonansowy transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki (lub Förstera) (lub smFRET ) to technika biofizyczna stosowana do pomiaru odległości w skali 1-10 nanometrów w pojedynczych cząsteczkach , zwykle biomolekułach . Jest to aplikacja FRET , w której para fluoroforów donorowych i akceptorowych są wzbudzane i wykrywane na poziomie pojedynczej cząsteczki. W przeciwieństwie do „zespołu FRET”, który zapewnia sygnał FRET dużej liczby cząsteczek, FRET pojedynczej cząsteczki jest w stanie rozdzielić sygnał FRET każdej pojedynczej cząsteczki. Zmiana sygnału smFRET jest przydatna do ujawnienia informacji kinetycznych, których nie może dostarczyć pomiar zespołowy, zwłaszcza gdy system jest w równowadze bez zmian sygnału zespołowego/masowego. Można również zaobserwować heterogeniczność między różnymi cząsteczkami. Metodę tę zastosowano w wielu pomiarach dynamiki wewnątrzcząsteczkowej, takich jak fałdowanie/rozwijanie DNA/RNA/białek i innych zmian konformacyjnych, a także w dynamice międzycząsteczkowej, takiej jak reakcja, wiązanie, adsorpcja i desorpcja, które są szczególnie przydatne w czujnikach chemicznych, testach biologicznych i bioczujniki.

Metodologia

Schemat typowego eksperymentu smFRET (A), krzywa odległości FRET (B) i trajektoria czasowa (C).

Pomiary FRET pojedynczej cząsteczki są zwykle wykonywane na mikroskopach fluorescencyjnych , przy użyciu cząsteczek unieruchomionych na powierzchni lub swobodnie dyfundujących. Pojedyncze pary FRET są oświetlane przy użyciu intensywnych źródeł światła, zwykle laserów , w celu wygenerowania wystarczających sygnałów fluorescencyjnych, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych cząsteczek. Wielofotonowa mikroskopia szerokokątna jest zwykle połączona z mikroskopem fluorescencyjnym całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) . To selektywnie wzbudza pary FRET na powierzchni komory pomiarowej i odrzuca szum z większości próbki. Alternatywnie, mikroskopia konfokalna minimalizuje tło, skupiając światło fluorescencyjne na otworku, aby odrzucić nieostre światło. Objętość konfokalna ma średnicę około 220 nm i dlatego należy ją zeskanować, jeśli potrzebny jest obraz próbki. Przy wzbudzeniu konfokalnym możliwy jest pomiar znacznie głębiej w próbce niż przy użyciu TIRF. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany za pomocą ultraczułych kamer CCD lub naukowych kamer CMOS do mikroskopii szerokokątnej lub SPAD do mikroskopii konfokalnej. Gdy dostępne są intensywności pojedynczej cząsteczki w funkcji czasu, można obliczyć wydajność FRET dla każdej pary FRET w funkcji czasu, a tym samym możliwe jest śledzenie zdarzeń kinetycznych w skali pojedynczej cząsteczki i zbudowanie histogramów FRET pokazujących rozkład stanów w każda cząsteczka. Jednak dane z wielu par FRET muszą być rejestrowane i łączone w celu uzyskania ogólnych informacji o próbce lub strukturze dynamicznej.

Unieruchomiony na powierzchni

W eksperymentach unieruchomionych na powierzchni biomolekuły znakowane znacznikami fluorescencyjnymi są wiązane z powierzchnią szkiełka nakrywkowego i rejestrowane są obrazy fluorescencji (zwykle przez CCD lub naukowe kamery CMOS ). Zbieranie danych za pomocą kamer spowoduje utworzenie filmów z próbki, które należy przetworzyć w celu uzyskania intensywności pojedynczej cząsteczki w czasie. Jeśli mikroskop konfokalny z SPAD używany jest detektor, wyszukiwanie cząsteczek odbywa się najpierw poprzez skanowanie próbki. Następnie punkt konfokalny znajduje się na cząsteczce i bezpośrednio zbiera dane o intensywności w czasie, dając, że dryf próbki jest pomijalny lub do śledzenia cząsteczki używana jest aktywna pętla sprzężenia zwrotnego.

Zaletą eksperymentów unieruchomionych na powierzchni jest to, że wiele cząsteczek można obserwować równolegle przez dłuższy okres czasu, aż do fotowybielenia (zwykle 1-30 s). Pozwala to na wygodne badanie przejść zachodzących w wolnych skalach czasowych. Wadą są dodatkowe modyfikacje biochemiczne potrzebne do połączenia cząsteczek z powierzchnią oraz zakłócenia, jakie powierzchnia może potencjalnie wywierać na aktywność molekularną. Ponadto maksymalna rozdzielczość czasowa intensywności pojedynczych cząsteczek jest ograniczona przez czas akwizycji kamery (zwykle > 1 ms).

Swobodnie rozprzestrzeniający się

SmFRET można również wykorzystać do badania konformacji cząsteczek swobodnie dyfundujących w próbce cieczy. W swobodnie dyfuzyjnych eksperymentach smFRET (lub smFRET opartych na dyfuzji), te same biomolekuły mogą swobodnie dyfundować w roztworze, będąc jednocześnie wzbudzane przez małą objętość wzbudzenia (zwykle plamka o ograniczonej dyfrakcji ). Rozbłyski fotonów spowodowane przejściem pojedynczej cząsteczki przez miejsce wzbudzenia są rejestrowane za pomocą SPAD detektory. Punkt konfokalny jest zwykle ustalany w danej pozycji (nie następuje skanowanie i nie jest uzyskiwany obraz). Zamiast tego fotony fluorescencyjne emitowane przez poszczególne cząsteczki przekraczające objętość wzbudzenia są rejestrowane i gromadzone w celu zbudowania rozkładu różnych populacji obecnych w próbce. W zależności od złożoności tej dystrybucji, czas akwizycji waha się od ~5 minut do kilku godzin.

Charakterystyczną zaletą konfiguracji wykorzystujących detektory SPAD jest to, że nie są one ograniczone „liczbą klatek” ani stałym czasem integracji, jak w przypadku korzystania z kamer. W rzeczywistości, w przeciwieństwie do kamer, SPAD wytwarzają impuls za każdym razem, gdy wykryty jest foton, podczas gdy dodatkowa elektronika jest potrzebna do „znacznika czasu” każdego impulsu z rozdzielczością 10-50 ns. Wysoka rozdzielczość czasowa konfokalnych jednocząsteczkowych pomiarów FRET pozwala obserwatorom potencjalnie wykrywać dynamikę w skalach czasowych tak niskich jak 10 μs. Jednak wykrywanie „powolnych” przejść w skalach czasowych dłuższych niż czas dyfuzji (zwykle ~ 1 ms) jest trudniejsze niż w eksperymentach unieruchomionych na powierzchni i generalnie wymaga znacznie dłuższych akwizycji.

Zwykle emisja fluorescencyjna fluoroforów donorowych i akceptorowych jest wykrywana przez dwa niezależne detektory, a sygnał FRET jest obliczany ze stosunku intensywności w dwóch kanałach. Niektóre konfiguracje konfiguracji dalej dzielą każdy kanał widmowy (donorowy lub akceptorowy) na dwie ortogonalne polaryzacje (dlatego wymagają 4 detektorów) i są w stanie mierzyć zarówno FRET, jak i anizotropię fluorescencji w tym samym czasie. W innych konfiguracjach jednocześnie rejestrowane są 3 lub 4 kanały widmowe w celu jednoczesnego pomiaru wielu par FRET. Zarówno lasery CW, jak i pulsacyjne mogą być używane jako źródła wzbudzenia. Podczas korzystania z laserów pulsacyjnych odpowiedni sprzęt do akwizycji może mierzyć czas nadejścia fotonu w odniesieniu do ostatniego impulsu laserowego z rozdzielczością pikosekundową w tak zwanej skorelowanej w czasie z liczeniem pojedynczych fotonów (TCSPC). W tej konfiguracji każdy foton charakteryzuje się makroczasem (tj. zgrubnym znacznikiem czasu 10-50 ns) i mikroczasem (tj. opóźnieniem w stosunku do ostatniego impulsu lasera). Te ostatnie można wykorzystać do wyodrębnienia informacji o czasie życia i uzyskania sygnału FRET.

Analiza danych

Typowe dane smFRET systemu dwubarwnikowego to trajektorie czasowe intensywności emisji fluorescencji barwnika dawcy i barwnika akceptora, zwane dwoma kanałami. Do uzyskania emisji dwóch barwników stosuje się głównie dwie metody: (1) pomiar akumulacyjny wykorzystuje stały czas naświetlania kamer dla każdej klatki, takich jak kamera PMT, APD, EMCCD i CMOS; (2) sekwencja czasu nadejścia pojedynczego fotonu mierzona za pomocą detektorów PMT lub APD. Zasada polega na użyciu filtrów optycznych lub luster dichroicznych w celu oddzielenia emisji dwóch barwników i zmierzenia ich w dwóch kanałach. Na przykład konfiguracja wykorzystująca dwie połówki urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) omówiono w literaturze.

W przypadku systemu z dwoma barwnikami sygnały emisji są następnie wykorzystywane do obliczenia wydajności FRET między barwnikami w czasie. Wydajność FRET to liczba fotonów wyemitowanych z barwnika akceptorowego w stosunku do sumy emisji barwnika donorowego i akceptorowego. Trajektorie czasowe wytworzone w każdym eksperymencie mogą zawierać sygnały z niepełnego lub nieprawidłowego oznakowania, a nawet agregaty. Aby to wyjaśnić, wiele grup badawczych opracowało wyrafinowane narzędzia do selekcji śledzenia czasu w oparciu o wiele metryk lub przy użyciu głębokiej sieci neuronowej. Zwykle wzbudzany jest tylko barwnik donorowy, ale jeszcze dokładniejsze informacje można uzyskać, jeśli barwnik donorowy i akceptorowy są wzbudzane naprzemiennie. W schemacie pojedynczego wzbudzenia emisja barwników donorowych i akceptorowych to po prostu liczba fotonów zebranych dla dwóch barwników podzielona przez skuteczność zbierania fotonów odpowiednio dwóch kanałów, które są funkcjami wydajności zbierania, filtra i sprawności optycznej oraz wydajność kamery dla dwóch pasm długości fali. Te wydajności można skalibrować dla danej konfiguracji instrumentalnej.

{\ Displaystyle FRET = {\ Frac {\ tfrac {I_ {A}}} {\ eta _ {A} Q_ {A}}} {{\ tfrac {I_ {A}}} {\ eta _ {A} Q_ {A }}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}.}

$mierzone liczby$ FRET to wydajność FRET układu dwubarwnikowego w pewnym okresie czasu, są $.$ kanału akceptora i dawcy w tym samym okresie czasu i $są$ $Q_$ zbierania fotonów w dwóch kanałach i η $}$ i ${\ Displaystyle Q_ {D}}$ są wydajnością kwantową dwóch barwników. $barwnika$ ten sposób oblicza się rzeczywistą liczbę fotonów emitowanych Jeśli wydajność zbierania fotonów w dwóch kanałach jest podobna, a rzeczywista odległość FRET nie jest interesująca, można ustawić dwa = 1, a dwa kwantowe również dają 1. ${\ displaystyle \ eta}$

( A ) Przykładowa trajektoria czasowa zliczeń fotonów kanału akceptora (czerwony) i donora (niebieski) zebranych z rozdzielczością czasową 1 ms. (B) Dane zostały podzielone na przedziały w rozdzielczości czasowej 10 ms, aby zredukować szum. Wstawka pokazuje trajektorię czasową smFRET obliczoną za pomocą równania. Większa część fotozliczeń ma duży szum zdominowany przez zależny od liczby szum Gaussa, a obszar małych fotozliczeń jest zdominowany przez szum Poissona.

Dla danych skumulowanej emisji smFRET trajektorie czasowe zawierają głównie następujące informacje: (1) przejścia stanów, (2) szum, (3) rozmycie kamery (analog rozmycia ruchu), (4) fotomruganie i fotowybielanie barwników . Informacje o zmianie stanu to informacje, których potrzebuje typowy pomiar. Jednak pozostałe sygnały zakłócają analizę danych i dlatego należy się nimi zająć.

Listę pakietów oprogramowania można znaleźć na stronie KinSoftChallenge. Raport na temat wyników porównania między tymi pakietami oprogramowania można znaleźć tutaj.

Hałas

Sygnał szumu emisji barwnika zazwyczaj zawiera szum odczytu z kamery, szum strzału i szum biały oraz rzeczywisty szum próbki, z których każdy ma inny rozkład szumu ze względu na różne źródła. Prawdziwy szum próbki pochodzi z zaburzeń termicznych systemu, które powodują poszerzenie odległości FRET, nierównomierny rozkład orientacji barwnika, zmiany emisji barwnika, szybkie miganie i kinetykę szybszą niż czas całkowania. Powolne zmiany emisji barwnika są prawdopodobnie uważane za stany fałszywie dodatnie, których należy eksperymentalnie unikać, wybierając różne barwniki. Pozostałe szumy pochodzą ze ścieżki wzbudzenia i ścieżki detekcji, zwłaszcza z kamery. Ostatecznie szum surowych danych o emisji jest kombinacją szumów z Rozkład Poissona i rozkład Gaussa . Czasami szumy w każdym kanale (np. dla detektorów jednofotonowych) można uprościć do sumy szumu gaussowskiego zależnego od natężenia (im wyższa liczba, tym większy szum; jest to połączenie szumu gaussowskiego i szumu poissowskiego o większej amplitudzie, który może być reprezentowany przez funkcję Gaussa) i szum tła Poissona (niezależny od liczby sygnałów). Ten ostatni szum dominuje, gdy kanał jest wyłączony lub ma niską intensywność (prawy rysunek). Szumy w dwóch kanałach są następnie łączone w nieliniowe równanie wymienione powyżej w celu obliczenia wartości FRET. Zatem szum na trajektoriach smFRET jest bardzo skomplikowany. Szum jest asymetryczny powyżej i poniżej średnich wartości FRET, a jego wielkość zmienia się w kierunku dwóch końców (0 i 1) wartości FRET z powodu zmieniających się niepewności kanałów A i D. Większość szumów można zredukować, grupując dane (patrz rysunek) kosztem utraty rozdzielczości czasowej. Zobacz GitHub (postFRET), aby zapoznać się z przykładem kodów MATLAB do symulacji trajektorii czasowych smFRET bez i z szumem (link GitHub).

Rozmycie aparatu

Symulacja rozmycia kamery z przykładowym 3-stanowym smFRET przy użyciu symulatora postFRET (dwie symulacje). Stosunek sygnału do szumu jest ustawiony na około 20 dla obu symulacji. Rozdzielczość czasowa jest symulowana przy 1 ms, a następnie dzielona do 10 ms, czyli czasu całkowania symulowanych eksperymentów. Stałe szybkości symulacji są wymienione po lewej stronie, niewielka część trajektorii jest pokazana pośrodku (alternatywne kolory reprezentują różne cząsteczki), a histogram FRET wszystkich cząsteczek (100) jest pokazany po prawej stronie.

Sygnał rozmycia kamery wynika z dyskretnego charakteru pomiarów. Sygnał emisji jest niezgodny z rzeczywistym sygnałem przejścia, ponieważ jeden lub oba są stochastyczne (losowe). Kiedy następuje zmiana stanu pomiędzy odczytem dwóch przedziałów odczytu emisji, sygnał jest średnią z dwóch części w tym samym oknie pomiarowym, co następnie wpływa na dokładność identyfikacji stanu i ostatecznie na analizę stałej szybkości. Jest to mniejszy problem, gdy częstotliwość pomiaru jest znacznie większa niż szybkość przejścia, ale staje się prawdziwym problemem, gdy zbliżają się do siebie (rysunek po prawej). Aby odzwierciedlić efekt rozmycia kamery w symulowanych trajektoriach smFRET, należy symulować dane w wyższej rozdzielczości czasowej (np. 10 razy szybciej) niż czas zbierania danych, a następnie podzielić dane na ostateczne trajektorie. Zobacz GitHub (postFRET), aby zapoznać się z przykładowymi kodami MATLAB do symulacji trajektorii czasowych smFRET z szybszą rozdzielczością czasową, a następnie połączyć je z rozdzielczością czasową pomiaru (czas integracji), aby zasymulować efekt rozmycia kamery.

Fotomruganie i fotowybielanie

Trajektorie czasowe zawierają również informacje o fotomruganiu i fotowybielaniu dwóch barwników. Informacje te muszą zostać usunięte, co powoduje powstawanie luk w trajektorii czasu, w których informacje FRET są tracone. Informacje o fotomruganiu i fotowybielaniu można usunąć dla typowego układu barwnika ze stosunkowo długimi interwałami fotomrugania i czasem życia fotowybielania, które zostały wybrane w pomiarze. W związku z tym stanowią mniejszy problem przy analizie danych. Jednak dużym problemem stanie się użycie barwnika o krótkich odstępach między mrugnięciami lub długiej żywotności w stanie ciemnym. Aby złagodzić te dwa problemy, opracowano specjalne rozwiązania chemiczne, takie jak roztwory zmiataczy tlenu lub wygaszacze stanu trypletowego.

Algorytmy identyfikacji stanu

Do analizy danych opracowano kilka metod analizy danych, takich jak metody progowania, ukryty model Markowa (HMM) i metody identyfikacji punktów przejścia. Metody progowe po prostu ustawiają próg między dwoma sąsiednimi stanami na trajektoriach smFRET. Wartości FRET powyżej progu należą do jednego stanu, a wartości poniżej do innego. Ta metoda działa dla danych o bardzo wysokim stosunku sygnału do szumu, a więc z rozróżnialnymi stanami FRET. Metoda ta jest intuicyjna i ma długą historię zastosowań. Przykładowy kod źródłowy można znaleźć w oprogramowaniu postFRET. HMM opierają się na algorytmach, które statystycznie obliczają funkcje prawdopodobieństwa każdego przypisania stanu, czyli dodają kary do mniej prawdopodobnego przypisania. Typowe pakiety oprogramowania z otwartym kodem źródłowym można znaleźć w Internecie, takie jak HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET itp. Analiza punktu przejścia lub analiza punktu zmiany (CPA) wykorzystuje algorytmy do identyfikacji, kiedy następuje przejście trajektorii w czasie za pomocą analizy statystycznej. Na przykład CPA na podstawie informacji Fishera i metoda testu t-Studenta (STaSI, open-source, GitHub link) identyfikuje przejścia stanów i minimalizuje długość opisu poprzez wybór optymalnej liczby stanów, tj. równoważenie kary za szum i całkowitej liczby stanów.

Analiza stawek

Po zidentyfikowaniu stanów można je wykorzystać do obliczenia odległości przenoszenia energii rezonansu Förstera i stałych szybkości przejścia między stanami. W przypadku równoległej macierzy reakcji między stanami, stałych szybkości każdego przejścia nie można wyciągnąć ze średnich czasów życia każdego przejścia, które są ustalane jako odwrotna suma stałych szybkości. Czasy życia przejść z jednego stanu do wszystkich innych stanów są „takie same” dla pojedynczej cząsteczki. Jednak stałe szybkości można obliczyć z funkcji prawdopodobieństwa, liczby każdego przejścia w całkowitym czasie stanu, z którego się przechodzi.

{\ Displaystyle k_ {jeśli} = {\ Frac {N_ {jeśli}} {\ suma _ {f = 1} ^ {f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}}

Przykładowa trajektoria stanu i histogram czasu przebywania dla każdego przejścia. Czas życia to średnia wszystkich czasów przebywania, która jest odwrotnością sumy wszystkich stałych szybkości stanu względem innych stanów.

gdzie i to stan początkowy, f to stan końcowy przejścia, N to liczba tych przejść na trajektoriach czasowych, n to całkowita liczba stanów, k to stała szybkości, t to czas każdego stanu przed następuje przejście. Na przykład jeden mierzy 130 sekund (s) trajektorii czasowych smFRET. Całkowity czas przebywania cząsteczki w stanie pierwszym wynosi t ₁ = 100 sekund (s), w stanie drugim t ₂ = 20 s, a w stanie trzecim t ₃ = 10 sek. Wśród 100 s cząsteczka pozostaje w stanie pierwszym, przechodzi do stanu drugiego 70 razy i przechodzi do stanu trzeciego 30 razy na koniec czasu przebywania, stała szybkości przejścia ze stanu 1 do stanu 2 wynosi zatem k 12 = _70/100 = 0,7 s ⁻¹ , stała szybkości stanu 1 do stanu 3 wynosi k ₁₃ = 30/100 = 0,3 s ⁻¹ . Zazwyczaj prawdopodobieństwa długości przejścia 70-krotnego lub 30-krotnego (czasy przebywania) mają rozkład wykładniczy (prawy rysunek). Średnie czasy przebywania dwóch rozkładów stanu pierwszego, tj. dwóch okresów życia, τ ₁₂ i τ ₁₃ są takie same w czasie 1 s dla tych dwóch przejść (prawy rysunek). Liczba przejść N może być całkowitą liczbą przejść stanów lub dopasowaną amplitudą wykładniczej funkcji zaniku skumulowanego histogramu czasów przebywania stanu. To ostatnie działa tylko w przypadku dobrze wychowanych rozkładów czasu przebywania. System w równowadze, w którym każdy stan przechodzi równolegle do wszystkich innych w reakcjach pierwszego rzędu, jest szczególnym przypadkiem ułatwiającym zrozumienie. Gdy system nie jest w równowadze, to równanie nadal obowiązuje, ale należy zachować ostrożność, aby z niego korzystać.

Interpretacja powyższego równania opiera się po prostu na założeniu, że każda cząsteczka jest taka sama, hipotezie ergodycznej . Istnienie każdego stanu jest po prostu reprezentowane przez jego całkowity czas, który jest jego "koncentracją". Zatem szybkość przejścia do dowolnego innego stanu to liczba przejść znormalizowana przez to stężenie. Liczbowo stężenie w czasie można przekształcić w stężenie liczbowe, aby naśladować pomiar zespołowy. Ponieważ pojedyncze cząsteczki są takie same jak wszystkie inne cząsteczki, możemy założyć, że trajektoria czasowa jest przypadkową kombinacją wielu cząsteczek, z których każda zajmuje tylko bardzo krótki okres czasu, powiedzmy 𝛿 t . Zatem „stężenie” cząsteczki w stanie n wynosi c _n = t _n / 𝛿 t . Spośród wszystkich tych „molekuł”, jeśli N _nf przejdzie do stanu f w tym czasie pomiarowym 𝛿 t , to z definicji szybkość przejścia wynosi r = N _nf / 𝛿 t = k _nf c _n . Zatem k _nf = N _nf / t _n .

Można zauważyć, że pomiar stałej szybkości pojedynczej cząsteczki zależy tylko od hipotezy ergodycznej, którą można ocenić, jeśli zmierzy się statystycznie wystarczającą liczbę pojedynczych cząsteczek i zaobserwuje się oczekiwane, dobrze zachowane rozkłady czasów przebywania. Heterogeniczność między pojedynczymi cząsteczkami można również zaobserwować, jeśli każda cząsteczka ma rozróżnialny zestaw stanów lub zestaw stałych szybkości.

Zmniejsz poziom niepewności

Poziom niepewności analizy wskaźnika można oszacować na podstawie wielu prób eksperymentalnych, analizy ładowania początkowego i analizy błędów dopasowania. Błędne przypisanie stanu jest częstym źródłem błędów podczas analizy danych, które wynikają z poszerzenia stanu, szumu i rozmycia kamery. Podział danych , średnia ruchoma i transformacja falkowa mogą pomóc zredukować efekt poszerzenia stanu i szumu, ale wzmocnią efekt rozmycia kamery.

Efekt rozmycia aparatu można zredukować dzięki większej częstotliwości próbkowania, która opiera się na opracowaniu bardziej czułego aparatu, specjalnej analizie danych lub obu. Tradycyjnie w HMM punkt danych przed i po przejściu jest specjalnie przypisywany, aby zredukować niewłaściwą częstotliwość przypisywania tych punktów danych do stanów pomiędzy przejściami. Istnieje jednak ograniczenie działania tej metody. Kiedy częstotliwość przejścia zbliża się do częstotliwości próbkowania, zbyt wiele danych jest rozmytych, aby ta metoda zadziałała (patrz powyżej rysunek rozmycia kamery). Zgłoszono, że eksperymentalne podejście z wykorzystaniem lasera impulsowego częściowo przezwycięża efekt rozmycia aparatu bez bardzo szybkiego aparatu. Chodzi o to, aby oświetlać tylko bardzo krótki okres w każdym cyklu zbierania danych z kamery, aby uniknąć uśredniania sygnału w każdym cyklu.

Zgłoszono również dwuetapową metodę analizy danych, która zwiększa dokładność analizy danych rozmytych przez aparat. Pomysł polega na symulowaniu trajektorii metodą symulacji Monte Carlo i porównaniu jej z danymi eksperymentalnymi. W odpowiednich warunkach zarówno symulacja, jak i dane eksperymentalne będą zawierały ten sam stopień rozmycia informacji i szumu. Ta symulowana trajektoria jest lepszą odpowiedzią niż surowe dane eksperymentalne, ponieważ jej podstawowa prawda jest „znana”. Ta metoda ma kody open source dostępne jako postFRET (link GitHub) i MASH-FRET. Ta metoda może również nieznacznie skorygować efekt szumu niegaussowskiego, który spowodował problemy z dokładną identyfikacją stanów za pomocą metod statystycznych.

Obecna analiza danych dla smFRET nadal wymaga wielkiej staranności i specjalnego szkolenia, wymagając, aby algorytmy głębokiego uczenia się odegrały rolę w uwolnieniu pracy w analizie danych.

Zalety

Porównanie schematycznych wyników pomiarów masy (pomarańczowy), zespołu FRET (czarny) i smFRET systemu z trzema stanami (1-3). Pomiar masowy dodaje wszystkie stany, a smFRET rozwiązuje każdy z nich, zliczając populację cząsteczek w każdym stanie w czasie. Informacje kinetyczne są ukryte w pomiarach zbiorczych i zespołowych, ale można je zaobserwować w pomiarze smFRET, analizując przejścia między poszczególnymi stanami w czasie.

SmFRET pozwala na dokładniejszą analizę heterogenicznych populacji i ma kilka zalet w porównaniu do FRET zespołowego.

Jedną z zalet badania odległości w pojedynczych cząsteczkach jest to, że heterogeniczne populacje można badać dokładniej z wartościami specyficznymi dla każdej cząsteczki, zamiast obliczania średniej na podstawie zespołu. Pozwala to na badanie określonych jednorodnych populacji w obrębie heterogenicznej populacji. Na przykład, jeśli dwie istniejące populacje homologiczne w obrębie populacji heterogenicznej mają różne wartości FRET, analiza FRET zbiorcza da średnią ważoną wartość FRET reprezentującą populację jako całość. Tak więc uzyskana wartość FRET nie daje danych dotyczących dwóch odrębnych populacji. W przeciwieństwie do tego smFRET byłby w stanie rozróżnić dwie populacje i pozwoliłby na analizę istniejących populacji homologicznych.

SmFRET zapewnia również dynamiczną rozdzielczość czasową pojedynczej cząsteczki, której nie można uzyskać za pomocą zespołowych pomiarów FRET. Ensemble FRET ma zdolność wykrywania dobrze zaludnionych stanów przejściowych , które gromadzą się w populacji, ale brakuje mu zdolności do charakteryzowania półproduktów , które są krótkotrwałe i nie kumulują się. Limit ten jest uwzględniany przez smFRET, który oferuje bezpośredni sposób obserwowania półproduktów pojedynczych cząsteczek niezależnie od akumulacji. Kiedy obserwujesz wystarczająco długi czas na cząsteczce, będą zdarzenia stanu przejściowego, które będą trwać wystarczająco długo, aby odróżnić je od szumu lub poszerzenia innych stanów. Dlatego smFRET wykazuje zdolność do przechwytywania przejściowych subpopulacji w heterogenicznym środowisku.

Informacje kinetyczne w systemie będącym w równowadze są tracone na poziomie zespołu, ponieważ żadne ze stężeń reagentów i produktów nie zmienia się w czasie. Jednak na poziomie pojedynczej cząsteczki transfer między reagentami a produktami może zachodzić z mierzalną szybkością i być równoważony w czasie stochastycznie. W ten sposób śledzenie trajektorii czasowej konkretnej cząsteczki umożliwia bezpośredni pomiar stałej szybkości każdego etapu przejścia, w tym półproduktów, które są ukryte na poziomie zespołu ze względu na ich niskie stężenia. Pozwala to na wykorzystanie smFRET do badania DNA , RNA i białek dynamika składania. Podobnie jak w przypadku fałdowania białek , fałdowanie DNA i RNA przechodzi przez wiele interakcji, ścieżek fałdowania i półproduktów, zanim osiągnie stan natywny.

Wykazano również, że SmFRET lepiej wykorzystuje system trójkolorowy niż zespół FRET. Używając dwóch fluoroforów akceptorowych zamiast jednego, FRET może obserwować wiele miejsc skorelowanych ruchów i zmian przestrzennych w dowolnej złożonej cząsteczce. Pokazują to badania przeprowadzone na Holliday Junction . SmFRET z trójkolorowym systemem oferuje wgląd w zsynchronizowane ruchy trzech helikalnych miejsc skrzyżowania i prawie nieistnienie jego stanów równoległych. Ensemble FRET może również używać systemu trójkolorowego. Jednak nad wszelkimi oczywistymi zaletami przeważają wymagania systemu trójkolorowego, które obejmują wyraźną separację sygnałów fluoroforowych. Aby wyraźnie rozróżnić sygnał, nakładanie się FRET musi być małe, ale to również osłabia siłę FRET. SmFRET koryguje swoje ograniczenia nakładania się, używając filtry środkowoprzepustowe i lustra dichroiczne , które wzmacniają sygnał między dwoma akceptorami fluorescencji i rozwiązują wszelkie efekty przenikania.

Aplikacje

Głównym zastosowaniem smFRET jest analiza najdrobniejszych niuansów biochemicznych, które ułatwiają fałdowanie białek . W ostatnich latach opracowano wiele technik badania interakcji pojedynczych cząsteczek, które biorą udział w fałdowaniu i rozwijaniu białek. Techniki sondy siłowej , wykorzystujące mikroskopię sił atomowych i pęsetę laserową , dostarczyły informacji na temat stabilności białek. smFRET pozwala naukowcom badać interakcje molekularne za pomocą fluorescencji. Rezonansowy transfer energii Forstera (FRET) został po raz pierwszy zastosowany do pojedynczych cząsteczek przez Ha i in. i zastosowany do fałdowania białek w pracy Hochstrassera, Weissa i in. Zaletą smFRET jako całości w analizie interakcji molekularnych jest możliwość bezpośredniego testowania interakcji pojedynczych cząsteczek bez konieczności uśredniania zbiorów danych. W analizie fałdowania białek eksperymenty zespołowe obejmują wykonywanie pomiarów wielu białka , które znajdują się w różnych stanach przejściowych między stanem złożonym i niezłożonym . Po uśrednieniu struktura białka, którą można wywnioskować z zestawu danych, zapewnia jedynie podstawowy model strukturalny fałdowania białka. Jednak prawdziwe zrozumienie fałdowania białek wymaga rozszyfrowania sekwencji zdarzeń strukturalnych wzdłuż ścieżek fałdowania między stanami złożonymi i niezłożonymi. To właśnie w tej konkretnej gałęzi badań smFRET ma duże zastosowanie.

Badania FRET obliczają odpowiednie wydajności FRET w wyniku obserwacji zdarzeń fałdowania białek z rozdzielczością czasową . Te wydajności FRET można następnie wykorzystać do wywnioskowania odległości między cząsteczkami w funkcji czasu. Gdy białko przechodzi między stanami złożonymi i niezłożonymi, odpowiednie odległości między cząsteczkami mogą wskazywać na sekwencję interakcji molekularnych, które prowadzą do fałdowania białka.

Innym zastosowaniem smFRET jest dynamika fałdowania DNA i RNA. Zazwyczaj dwie różne lokalizacje nukleotydu są znakowane barwnikami donorowymi i akceptorowymi. Zmiana odległości między dwoma lokalizacjami zmienia się w czasie z powodu fałdowania i rozwijania nukleotydu oraz losowej dyfuzji dwóch punktów w czasie, w każdym oknie pomiarowym i pomiędzy różnymi oknami. Ze względu na złożoność trajektorii składania/rozkładania niezwykle trudno jest zmierzyć proces na poziomie zespołu. W ten sposób smFRET staje się kluczową techniką w tej dziedzinie. Oprócz wyzwań związanych z analizą danych smFRET, jednym z wyzwań jest oznaczenie wielu interesujących pozycji, a innym jest dwupunktowa dynamika w celu obliczenia ogólnych ścieżek fałdowania.

FRET pojedynczej cząsteczki można również zastosować do badania zmian konformacyjnych odpowiednich motywów kanałów w niektórych kanałach . Na przykład znakowane tetrameryczne kanały potasowe KirBac były znakowane fluoroforami donorowymi i akceptorowymi w określonych miejscach, aby zrozumieć dynamikę strukturalną w błonie lipidowej , co pozwoliło im uogólnić podobną dynamikę dla podobnych motywów w innych eukariotycznych kanałach Kir lub nawet kationach ogólnie kanały. Zastosowanie smFRET w tym eksperymencie pozwala na wizualizację zmian konformacyjnych, których nie można zobaczyć, jeśli pomiary makroskopowe są po prostu uśredniane. Doprowadzi to do analizy zespołowej, a nie analizy pojedynczych cząsteczek i zmian konformacyjnych w ich obrębie, co pozwoli nam uogólnić podobną dynamikę dla podobnych motywów w innych kanałach eukariotycznych .

Dynamika strukturalna kanału KirBac została dokładnie przeanalizowana zarówno w stanie otwartym, jak i zamkniętym, w zależności od obecności ligandu PIP2 . Część wyników opartych na smFRET wykazała strukturalną sztywność regionu zewnątrzkomórkowego . Filtr selektywności i zewnętrzną pętlę regionu filtra selektywności wyznakowano fluoroforami i zaobserwowano sprzężenie konformacyjne. Poszczególne trajektorie smFRET silnie wykazały wydajność FRET około 0,8 bez wahań, niezależnie od stanu kanału.

Ostatnio do ilościowego wykrywania docelowego DNA i rozróżniania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu zastosowano jednocząsteczkowy FRET. W przeciwieństwie do zespołowego FRET, jednocząsteczkowy FRET umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym zdarzeń wiązania celu. Dodatkowo niskie tło i wysoki stosunek sygnału do szumu obserwowany w technice FRET pojedynczej cząsteczki prowadzi do ultraczułości (granica wykrywalności w zakresie femtomolowym). granica wykrywalności.

Ograniczenia

Pomimo dokonywania przybliżonych szacunków, ograniczeniem smFRET jest trudność w uzyskaniu prawidłowej odległości związanej z transferem energii. Wymóg dokładnego oszacowania odległości stanowi poważne wyzwanie, ponieważ fluorescencja fluoroforów donorowych i akceptorowych, a także transfer energii zależą od środowiska i orientacji barwników, które mogą się różnić w zależności od elastyczności miejsca fluorofory są związane. Ponadto rzeczywista odległość danego stanu może być dynamiczna, a zmierzona wartość reprezentuje średnią odległość w ramach czasowych zbierania. Kwestia ta nie jest jednak szczególnie istotna, gdy oszacowanie odległości dwóch fluoroforów nie musi być określone z dokładną i absolutną precyzją.

Wyodrębnianie informacji kinetycznych ze skomplikowanego systemu biologicznego z szybkością przejścia wynoszącą około kilku milisekund lub mniej pozostaje wyzwaniem. Obecne rozdzielczości czasowe takich pomiarów są zazwyczaj na poziomie milisekund z kilkoma raportami na poziomie mikrosekund. Istnieje teoretyczne ograniczenie fotofizyki barwników. Czas życia stanu wzbudzonego typowej cząsteczki barwnika organicznego wynosi około 1 nanosekundy. Aby uzyskać statystyczną pewność wartości FRET, potrzeba od dziesiątek do setek fotonów, co daje najlepszą możliwą rozdzielczość czasową rzędu 1 mikrosekundy. Aby osiągnąć ten limit, potrzebne jest bardzo silne światło (gęstość mocy rzędu 1×10 ¹⁰ W m ^-2 , 10 ⁷ słońce, zwykle uzyskiwane przez skupienie wiązki laserowej za pomocą mikroskopu), które często powodują fotouszkodzenia cząsteczek organicznych. Kolejnym ograniczeniem jest czas życia barwnika w procesie fotowybielania, który jest funkcją natężenia światła i stresu oksydacyjno-redukcyjnego środowiska. Czas życia fotowybielania typowego barwnika organicznego w typowych warunkach eksperymentalnych (gęstość mocy lasera zaledwie kilka słońc) wynosi kilka sekund lub kilka minut przy pomocy roztworów pochłaniających tlen. Zatem zdarzenia kinetyczne dłuższe niż kilka minut są trudne do zbadania za pomocą barwników organicznych. Zamiast barwników organicznych należy stosować inne sondy o dłuższej żywotności, takie jak kropki kwantowe, kropki polimerowe i całkowicie nieorganiczne barwniki.

Linki zewnętrzne