Zanurzenie oleju

Zasada mikroskopii zanurzeniowej. Ścieżka promieni ze środkiem immersyjnym (żółty) (lewa połowa) i bez (prawa połowa). Promienie (czarne) wychodzące z obiektu (czerwone) pod pewnym kątem i przechodzące przez szkiełko nakrywkowe (pomarańczowe, podobnie jak szkiełko na dole) mogą wejść do obiektywu (ciemnoniebieskie) tylko przy zastosowaniu immersji. W przeciwnym razie załamanie na granicy faz nakrywka-szkiełko-powietrze powoduje, że promień nie trafia w obiektyw i jego informacje zostają utracone.

Dwie immersyjne soczewki obiektywowe Leica. Soczewki obiektywowe immersyjne w oleju wyglądają powierzchownie identycznie jak soczewki immersyjne bezolejowe.

W mikroskopii świetlnej immersja w oleju jest techniką stosowaną w celu zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopu . Osiąga się to poprzez zanurzenie zarówno soczewki obiektywu , jak i preparatu w przezroczystym oleju o wysokim współczynniku załamania światła , zwiększając w ten sposób aperturę numeryczną soczewki obiektywu.

Bez oleju fale świetlne odbijają się od preparatu na szkiełku przez szkiełko nakrywkowe, przez powietrze i do soczewki mikroskopu (patrz kolorowy rysunek po prawej). O ile fala nie wychodzi pod kątem 90 stopni, wygina się, gdy uderza w nową substancję, a stopień wygięcia zależy od kąta. To zniekształca obraz. Powietrze ma zupełnie inny współczynnik załamania światła niż szkło, co powoduje większe wygięcie w porównaniu z olejem, który ma współczynnik bardziej podobny do szkła. Specjalnie wyprodukowany olej może mieć prawie dokładnie taki sam współczynnik załamania światła jak szkło, dzięki czemu soczewka zanurzona w oleju jest prawie tak skuteczna, jak próbka całkowicie szklana (co byłoby niepraktyczne).

Olejki immersyjne to przezroczyste oleje, które posiadają specyficzne właściwości optyczne i lepkościowe , niezbędne do stosowania w mikroskopii. Typowe stosowane oleje mają współczynnik załamania światła około 1,515. Obiektyw immersyjny w oleju to soczewka obiektywowa specjalnie zaprojektowana do użytku w ten sposób. Wiele kondensorów zapewnia również optymalną rozdzielczość, gdy soczewka kondensora jest zanurzona w oleju.

Podłoże teoretyczne

Soczewki rekonstruują światło rozproszone przez przedmiot. Aby pomyślnie osiągnąć ten cel, najlepiej byłoby zebrać wszystkie rzędy dyfrakcji. Jest to związane z kątem otwarcia soczewki i jej współczynnikiem załamania. Rozdzielczość mikroskopu definiuje się jako minimalną odległość wymaganą między dwoma badanymi obiektami, aby mikroskop mógł je rozróżnić jako oddzielne obiekty. Ta minimalna odległość jest oznaczona jako δ. Jeśli dwa obiekty są od siebie oddalone o odległość mniejszą niż δ, będą widoczne w mikroskopie jako pojedynczy obiekt.

Miarą zdolności rozdzielczej RP soczewki jest jej apertura numeryczna , NA:

${\ Displaystyle \ delta = {\ Frac {\ lambda} {\ operatorname {2NA}}}}$

gdzie λ jest długością fali światła. Widać z tego jasno, że dobra rozdzielczość (mała δ) jest związana z dużą aperturą numeryczną.

Apertura numeryczna soczewki jest zdefiniowana jako

${\ Displaystyle \ operatorname {NA} = n \ sin \ alfa _ {0} \;}$

₀ gdzie α to połowa kąta rozpiętego przez soczewkę obiektywu widzianą z próbki, a n to współczynnik załamania światła ośrodka między soczewką a próbką (≈1 dla powietrza).

₀ Najnowocześniejsze obiektywy mogą mieć aperturę numeryczną do 0,95. Ponieważ sin α jest zawsze mniejszy lub równy jedności (liczba „1”), apertura numeryczna nigdy nie może być większa niż jedność dla soczewki obiektywu w powietrzu. Jeśli jednak przestrzeń między soczewką obiektywu a preparatem zostanie wypełniona olejem, apertura numeryczna może uzyskiwać wartości większe od jedności. To dlatego, że olej ma współczynnik załamania większy niż 1.

Cele immersji w oleju

Używany obiektyw immersyjny

Z powyższego wynika, że ​​olej znajdujący się pomiędzy preparatem a soczewką obiektywu poprawia zdolność rozdzielczą o współczynnik 1/ n . Obiektywy zaprojektowane specjalnie do tego celu są znane jako obiektywy immersyjne.

Obiektywy immersyjne w oleju są używane tylko przy bardzo dużych powiększeniach, które wymagają dużej zdolności rozdzielczej. Obiektywy o dużym powiększeniu mają krótkie ogniskowe , co ułatwia stosowanie oleju. Olej nakłada się na preparat (mikroskop konwencjonalny), a stolik podnosi się, zanurzając obiektyw w oleju. (W mikroskopach odwróconych olej nakłada się na obiektyw).

Współczynniki załamania światła oleju i szkła w pierwszym elemencie soczewki są prawie takie same, co oznacza, że ​​załamanie światła po wejściu do obiektywu będzie niewielkie (olej i szkło są optycznie bardzo podobne). Aby zapewnić dokładne dopasowanie współczynników załamania światła, należy użyć odpowiedniego olejku immersyjnego dla obiektywu . Użycie soczewki olejowej z niewłaściwym olejkiem lub bez olejku spowoduje aberrację sferyczną. Siła tego efektu zależy od wielkości niedopasowania współczynnika załamania światła.

Immersję w oleju można generalnie stosować tylko w przypadku sztywno zamocowanych próbek, w przeciwnym razie napięcie powierzchniowe oleju może przesunąć szkiełko nakrywkowe, a tym samym przesunąć próbkę pod spodem. Może się to również zdarzyć w przypadku mikroskopów odwróconych, ponieważ szkiełko nakrywkowe znajduje się pod szkiełkiem.

Olejek immersyjny

Przed opracowaniem syntetycznych olejków immersyjnych w latach czterdziestych XX wieku szeroko stosowano olejek z drzewa cedrowego . Olejek cedrowy ma współczynnik załamania światła około 1,516. Apertura numeryczna obiektywów olejku z drzewa cedrowego wynosi na ogół około 1,3. Olejek cedrowy ma jednak szereg wad: pochłania światło niebieskie i ultrafioletowe, z wiekiem żółknie, ma wystarczającą kwasowość, aby przy wielokrotnym użyciu potencjalnie uszkodzić obiektywy (atakuje cement używany do łączenia soczewek ), a rozcieńczanie go rozpuszczalnikiem zmienia jego lepkość ( oraz współczynnik załamania światła i dyspersja ). Olejek cedrowy należy usunąć z obiektywu natychmiast po użyciu, zanim stwardnieje, ponieważ usunięcie utwardzonego oleju cedrowego może uszkodzić soczewkę.

We współczesnej mikroskopii częściej stosuje się syntetyczne olejki immersyjne, które eliminują większość tych problemów. Wartości NA 1,6 można osiągnąć przy użyciu różnych olejów. W przeciwieństwie do naturalnych olejków, oleje syntetyczne nie twardnieją na soczewce i zwykle można je pozostawić na obiektywie przez wiele miesięcy, chociaż w celu najlepszej konserwacji mikroskopu najlepiej usuwać olej codziennie. Z biegiem czasu olej może przedostać się do przedniej soczewki obiektywu lub do korpusu obiektywu i uszkodzić obiektyw. Istnieją różne rodzaje olejków immersyjnych o różnych właściwościach w zależności od rodzaju mikroskopii, którą będziesz wykonywać. Typ A i typ B to olejki immersyjne ogólnego przeznaczenia o różnych lepkościach. Olejek immersyjny typu F najlepiej stosować do obrazowania fluorescencyjnego w temperaturze pokojowej (23    °C), podczas gdy olej typu N jest przeznaczony do stosowania w temperaturze ciała (37 °C) do zastosowań w obrazowaniu żywych komórek. Wszystkie mają _D 1,515, całkiem podobnie do oryginalnego olejku cedrowego.

Zobacz też

• Litografia zanurzeniowa
• Materiał zgodny z indeksem
• Solidna soczewka zanurzeniowa
• Obiektyw zanurzeniowy w wodzie

• Practical Microscopy autorstwa LC Martina i BK Johnsona, Glasgow (1966).
• Mikroskopia świetlna JK Solberg, Tapir Trykk (2000).

Linki zewnętrzne

• „Cele mikroskopu: środki immersyjne” autorstwa Mortimera Abramowitza i Michaela W. Davidsona, Olympus Microscopy Resource Center (strona internetowa), 2002.
• „Immersion Oil Microscopy” , David B. Fankhauser, Biology at University of Cincinnati , Clermont College (strona internetowa), 30 grudnia 2004 r.
• „Historia soczewek olejowych” autorstwa Jima Sollidaya, Southwest Museum of Engineering, Communications and Computation (strona internetowa), 2007.
• „Immersion Oil and the Microscope”, John J. Cargille, New York Microscopical Society Yearbook , 1964 (poprawiony, 1985). (Zarchiwizowane w Cargille Labs (strona internetowa).)