Immobilizowany enzym

Unieruchomiony enzym to enzym o ograniczonej ruchliwości, przyłączony do obojętnego, nierozpuszczalnego materiału, takiego jak alginian wapnia (wytwarzany w reakcji mieszaniny roztworu alginianu sodu i roztworu enzymu z chlorkiem wapnia ). Może to zapewnić zwiększoną odporność na zmiany warunków, takich jak pH czy temperatura . Pozwala również na utrzymywanie enzymów na miejscu podczas całej reakcji, po czym są one łatwo oddzielane od produktów i mogą być ponownie użyte - jest to znacznie bardziej wydajny proces i dlatego jest szeroko stosowany w przemyśle do reakcji katalizowanych enzymami . Alternatywą dla immobilizacji enzymów jest immobilizacja całych komórek . Immobilizowane enzymy są łatwe w obsłudze, po prostu oddzielane od ich produktów i mogą być ponownie użyte.

Enzymy są biokatalizatorami, które odgrywają istotną rolę we wzmacnianiu reakcji chemicznych w komórkach, nie ulegając trwałej modyfikacji, nie marnując ani nie powodując utraty równowagi reakcji chemicznych. Chociaż właściwości enzymów są niezwykle unikalne, ich użyteczność w przemyśle jest ograniczona ze względu na brak możliwości ponownego użycia, stabilność i wysokie koszty produkcji.

Enzymy immobilizowane w kulkach żelu alginianowego

Historia

Pierwszy syntetyczny unieruchomiony enzym powstał w latach pięćdziesiątych XX wieku przez włączenie enzymu do matryc polimerowych lub związanie z substancjami nośnikowymi. Stosowano również procedurę sieciowania poprzez sieciowanie samego białka lub z dodatkiem materiałów obojętnych. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne metody immobilizacji. Na przykład wiązanie enzymu z wcześniej zsyntetyzowanymi materiałami nośnikowymi jest jak dotąd najbardziej preferowaną metodą. Nowo procedura sieciowania kryształów enzymu jest również uważana za ekscytujący substytut. Stopień wykorzystania immobilizowanych enzymów stale rośnie.

Rozważania

Przed wykonaniem jakichkolwiek technik unieruchamiania należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Konieczne jest zrozumienie chemicznego i fizycznego wpływu na enzym po unieruchomieniu. Stabilność enzymu i właściwości kinetyczne mogą ulec zmianie na przykład z powodu zmian warunków mikrośrodowiska enzymu po uwięzieniu, przyczepieniu materiału nośnikowego lub produktach działań enzymatycznych. Ponadto ważne jest rozważenie zachowania trzeciorzędowej struktury enzymu przed unieruchomieniem w celu uzyskania funkcjonalnego enzymu. Podobnie innym kluczowym miejscem dla funkcjonalności enzymu jest aktywne miejsce , które powinno być również utrzymywane podczas przyłączania enzymu do powierzchni w celu unieruchomienia, konieczne jest posiadanie selektywnej metody przyłączania powierzchni/materiału, aby nie otrzymać unieruchomionego, ale dysfunkcyjnego enzymu. W związku z tym istnieją trzy fundamentalne czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy produkcji funkcjonalnych immobilizowanych enzymów: immobilizacja wspiera selekcję, warunki i metody immobilizacji.

Wybór wsparcia

Aby materiał podporowy był idealny, musi być hydrofilowy , obojętny wobec enzymów, biokompatybilny , odporny na atak mikroorganizmów i ściskanie, a także musi być przystępny cenowo. Materiały pomocnicze mogą być organiczne lub nieorganiczne, syntetyczne lub naturalne (w zależności od składu), ponieważ w końcu są to rodzaje biomateriałów . Nie ma uniwersalnego rodzaju materiału nośnikowego, który można zastosować do immobilizacji wszystkich enzymów. Istnieją jednak powszechnie stosowane nośniki, takie jak nośniki na bazie krzemionki, żywice akrylowe , polimery syntetyczne , membrany aktywne i żywice wymienne. Jednym z najtrudniejszych procesów poprzedzających sam proces immobilizacji jest dobór materiału podporowego, ponieważ zależy on od rodzaju enzymu, odczynu mediów, polityki bezpieczeństwa hydrodynamiki i warunków reakcji. Ponieważ różne rodzaje nośników dają różne właściwości i właściwości fizyczne i chemiczne, które wpływają na działanie enzymów, takie jak: hydrofilowość / hydrofobowość , chemia powierzchni i wielkość porów.

Metody

Enzymy można immobilizować metodami fizycznymi lub chemicznymi, w tym:

Fizyczny

Adsorpcja

• Prosta metoda odwracalnej immobilizacji, polegająca na adsorbowaniu lub fizycznym przyłączaniu enzymów do substancji nośnej. Adsorpcja może zachodzić poprzez słabe siły niespecyficzne, takie jak van der waalsa , wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe, podczas gdy w wiązaniu jonowym enzymy są wiązane przez wiązania solne.
• Adsorpcja na szkle, kuleczkach alginianu lub matrycy: Enzym jest przyczepiony do zewnętrznej strony obojętnego materiału. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest najwolniejsza spośród wymienionych tutaj. Ponieważ adsorpcja nie jest reakcją chemiczną , miejsce aktywne unieruchomionego enzymu może zostać zablokowane przez matrycę lub kulkę, znacznie zmniejszając aktywność enzymu.

Uwięzienie

• Jest to nieodwracalna technika fizycznego unieruchamiania, którą można uznać za fizyczne ograniczenie enzymu w określonym obszarze/przestrzeni. Może być stosowany do zwiększania stabilności mechanicznej, a także może być stosowany do zmniejszania przypadków wypłukiwania enzymów. Ponieważ enzym w tym procesie nie oddziałuje chemicznie z polimerem/materiałem włókien nośnych/sieci, pozostaje on chroniony przed denaturacją w czasie.
• Zasadniczo enzym jest uwięziony w nierozpuszczalnych kulkach lub mikrosferach, takich jak kulki alginianu wapnia . Jednak te nierozpuszczalne substancje utrudniają napływ substratu i wychodzenie produktów.

Chemiczny

Sieciowanie

• Sieciowanie : kolejna nieodwracalna metoda, która nie wymaga materiału nośnego do przyłączenia cząsteczek enzymu. W tej technice cząsteczki enzymów są kowalencyjnie związane ze sobą, tworząc matrycę składającą się prawie wyłącznie z enzymu. Reakcja zapewnia, że ​​miejsce wiązania nie zakrywa miejsca aktywnego enzymu , na aktywność enzymu wpływa jedynie bezruch. Jednak nieelastyczność wiązań kowalencyjnych wyklucza właściwości samoleczenia wykazywane przez chemoadsorbowane samoorganizujące się monowarstwy. Zastosowanie cząsteczki rozdzielającej, takiej jak poli( glikol etylenowy). ) pomaga w tym przypadku w redukcji zawady sterycznej przez podłoże.

Wiązanie kowalencyjne

• Enzym jest związany kowalencyjnie z nierozpuszczalnym nośnikiem (takim jak żel krzemionkowy lub makroporowate kulki polimerowe z grupami epoksydowymi). Takie podejście zapewnia najsilniejszą interakcję enzym/nośnik, a więc najniższy wyciek białka podczas katalizy.
• Aktywność kowalencyjnie związanego enzymu zależy od kilku czynników, w tym: kształtu i wielkości materiału nośnikowego, rodzaju metody sprzęgania, składu i specjalnych warunków sprzęgania materiału nośnikowego.

Wiązanie znaczników powinowactwa: jest metodą immobilizacji łączącą metody fizyczne i chemiczne, w której enzymy mogą być immobilizowane na powierzchni, np. w materiale porowatym, przy użyciu niekowalencyjnych lub kowalencyjnych znaczników białkowych . Ta technologia została stworzona do celów oczyszczania białek. Technika ta ma ogólne zastosowanie i można ją przeprowadzić bez uprzedniego oczyszczania enzymatycznego, uzyskując w rezultacie czysty preparat. Stosuje się szkło porowate i jego pochodne, gdzie porowatą powierzchnię można dostosować pod względem hydrofobowości do danego enzymu.

Losowe a kierowane na stronę

Liczne enzymy o znaczeniu biotechnologicznym zostały unieruchomione na różnych podłożach (nieorganicznych, organicznych, kompozytowych i nanomateriałach) poprzez przypadkowe przyłączenie wielopunktowe. Jednak unieruchomienie poprzez przypadkową modyfikację chemiczną skutkuje heterogenną populacją białek, w której więcej niż jeden łańcuch boczny (aminowy, karboksylowy, tiolowy itp.) obecny w białkach jest połączony z nośnikiem z potencjalną redukcją aktywności z powodu ograniczenia dostępu substratu do miejsca aktywnego .

W przeciwieństwie do immobilizacji enzymu ukierunkowanej na miejsce, nośnik może być połączony z pojedynczym określonym aminokwasem (ogólnie N- lub C-końcem) w cząsteczce białka z dala od miejsca aktywnego. W ten sposób zachowana jest maksymalna aktywność enzymu dzięki swobodnemu dostępowi substratu do miejsca aktywnego. Strategie te są głównie chemiczne, ale mogą dodatkowo wymagać metod genetycznych i enzymatycznych w celu wytworzenia grup funkcyjnych (których nie ma w białku) na nośniku i enzymie.

Wybór metody SDCM zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj enzymu (mniej stabilny psychrofilny lub bardziej stabilny termofilny homolog), stabilność pH enzymu, dostępność N- lub C-końca dla odczynnika, nieingerencja koniec enzymu z aktywnością enzymu, rodzajem katalitycznej reszty aminokwasowej, dostępnością, ceną i łatwością przygotowania odczynników. Na przykład generowanie komplementarnych klikalnych grup funkcyjnych (alkin i azydek) na nośniku i enzymie jest jednym z najwygodniejszych sposobów unieruchamiania enzymów poprzez ukierunkowaną modyfikację chemiczną.

Unieruchomienie podłoża

Innym szeroko stosowanym zastosowaniem podejścia immobilizacji wraz z enzymami były reakcje enzymatyczne na unieruchomionych substratach. Takie podejście ułatwia analizę aktywności enzymów i naśladuje zachowanie enzymów np. na ścianach komórkowych.

Użytek komercyjny

Immobilizowane enzymy mają ważne zastosowania, ponieważ obniżają koszty i poprawiają wynik reakcji, którą katalizują. Zalety obejmują:

Wygoda

Niewielkie ilości białka rozpuszczają się w reakcji, więc obróbka może być znacznie łatwiejsza. Po zakończeniu mieszaniny reakcyjne zazwyczaj zawierają tylko rozpuszczalnik i produkty reakcji.

Oszczędność

Unieruchomiony enzym jest łatwo usuwany z reakcji, co ułatwia recykling biokatalizatora . Jest to szczególnie przydatne w procesach takich jak produkcja mleka bez laktozy, ponieważ mleko można spuścić z pojemnika, pozostawiając w nim enzym ( laktazę ) gotowy do następnej partii.

Stabilność

Immobilizowane enzymy mają zwykle większą stabilność termiczną i operacyjną niż rozpuszczalna postać enzymu.

W przeszłości biologiczne proszki do prania i detergenty zawierały wiele proteaz i lipaz , które rozkładały brud. Jednak kontakt środków czyszczących ze skórą ludzką powodował reakcje alergiczne. Dlatego immobilizacja enzymów jest ważna w wielu dziedzinach zastosowań.

Immobilizowane enzymy znajdują zastosowanie w różnych zastosowaniach, m.in. w przemyśle spożywczym, chemicznym, farmaceutycznym i medycznym. Na przykład w przemyśle spożywczym immobilizowane enzymy są wykorzystywane do produkcji kilku rodzajów słodzików o zerowej kaloryczności, na przykład alluloza jest epimerem fruktozy , która różni się strukturalnie, co powoduje, że nie jest wchłaniana przez organizm ludzki po spożyciu. Inny przykład środków słodzących na bazie immobilizowanych enzymów obejmuje: tagatozę (immobilizowana β-galaktozydaza ).

Również w przemyśle chemicznym (kosmetycznym) immobilizowane enzymy są wykorzystywane do produkcji estrów zmiękczających skórę poprzez wykorzystanie immobilizowanego enzymu CalB. Pierwszą firmą, która zastosowała taką metodę, jest Evonik w 2000 roku. Enzym Lipase-CalB w stanie unieruchomionym jest faktycznie używany w innych zastosowaniach farmaceutycznych do produkcji Odanacatib i Sofosbuvir .