Jednostka tworząca kolonie

W mikrobiologii jednostka tworząca kolonie ( CFU, cfu lub Cfu ) to jednostka, która szacuje liczbę komórek drobnoustrojów ( bakterii , grzybów , wirusów itp.) w próbce, które są żywotne i zdolne do namnażania się poprzez rozszczepienie binarne w kontrolowanych warunkach . Liczenie za pomocą jednostek tworzących kolonie wymaga hodowania drobnoustrojów i liczenia tylko żywych komórek, w przeciwieństwie do badania mikroskopowego, które liczy wszystkie komórki, żywe lub martwe. Wizualny wygląd kolonii w hodowli komórkowej wymaga znacznego wzrostu, a przy liczeniu kolonii nie ma pewności, czy kolonia powstała z jednej komórki, czy z grupy komórek. Wyrażanie wyników jako jednostek tworzących kolonie odzwierciedla tę niepewność.

Teoria

Rozcieńczenie wykonane z bakterii i wody peptonowej umieszcza się na płytce agarowej ( liczba płytek agarowych w przypadku próbek żywności lub agar Trypticase soy agar w przypadku próbek klinicznych) i rozprowadza na płytce, przechylając zgodnie z pokazanym wzorem.

Celem liczenia płytek jest oszacowanie liczby obecnych komórek na podstawie ich zdolności do tworzenia kolonii w określonych warunkach pożywki, temperatury i czasu. Teoretycznie jedna zdolna do życia komórka może dać początek kolonii poprzez replikację. Jednak samotne komórki są wyjątkiem w naturze i najprawdopodobniej przodkiem kolonii była masa komórek zdeponowanych razem. ^{[ potrzebne źródło ]} Ponadto wiele bakterii rośnie w łańcuchach (np. Streptococcus ) lub skupiskach (np. Staphylococcus ). Oszacowanie liczby drobnoustrojów za pomocą CFU w większości przypadków zaniży liczbę żywych komórek obecnych w próbce z tych powodów. Dzieje się tak, ponieważ liczenie CFU zakłada, że każda kolonia jest oddzielna i założona przez pojedynczą, żywotną komórkę drobnoustroju.

Liczba płytek jest liniowa dla E. coli w zakresie od 30 do 300 CFU na płytce Petriego o standardowej wielkości . Dlatego zapewnienie, że próbka da CFU w tym zakresie, wymaga rozcieńczenia próbki i posiewu kilku rozcieńczeń. Zwykle stosuje się dziesięciokrotne rozcieńczenia, a serię rozcieńczeń umieszcza się w powtórzeniach 2 lub 3 w wybranym zakresie rozcieńczeń. Często nakłada się 100 µl, ale stosuje się również większe ilości do 1 ml. Większe objętości płytek wydłużają czas suszenia, ale często nie skutkują większą dokładnością, ponieważ mogą być potrzebne dodatkowe etapy rozcieńczania. CFU/płytkę odczytuje się z płytki w zakresie liniowym, a następnie matematycznie dedukuje się CFU/g (lub CFU/mL) oryginału, biorąc pod uwagę ilość na płytce i jej współczynnik rozcieńczenia (np. CLSI VET01S ) .

Roztwór bakterii o nieznanym stężeniu jest często rozcieńczany seryjnie w celu uzyskania co najmniej jednej płytki z policzalną liczbą bakterii. Na tym rysunku płytka „x10” jest odpowiednia do liczenia.

Zaletą tej metody jest to, że różne gatunki drobnoustrojów mogą tworzyć kolonie wyraźnie różniące się od siebie, zarówno mikroskopowo , jak i makroskopowo . Morfologia kolonii może być bardzo przydatna w identyfikacji obecnych mikroorganizmów. ^{[ potrzebne źródło ]}

Wcześniejsze zrozumienie anatomii mikroskopowej organizmu może dać lepsze zrozumienie, w jaki sposób obserwowane CFU/ml odnosi się do liczby żywych komórek na mililitr. Alternatywnie, w niektórych przypadkach możliwe jest zmniejszenie średniej liczby komórek na CFU poprzez worteksowanie próbki przed wykonaniem rozcieńczenia. Jednak wiele mikroorganizmów jest delikatnych i po umieszczeniu w wirze zmniejszyłby się odsetek komórek, które są zdolne do życia. ^{[ potrzebne źródło ]}

Notacja dziennika

Stężenia jednostek tworzących kolonie można wyrazić za pomocą notacji logarytmicznej, gdzie pokazana wartość jest logarytmem o podstawie 10 stężenia . Pozwala to logarytmu redukcji procesu odkażania jako prostego odejmowania.

Używa

Jednostki tworzące kolonie są używane do ilościowego określania wyników w wielu mikrobiologicznych metodach posiewania i liczenia, w tym:

Metoda Pour Plate, w której próbkę zawiesza się na szalce Petriego przy użyciu stopionego agaru schłodzonego do około 40–45 ° C (tuż powyżej punktu krzepnięcia, aby zminimalizować śmierć komórek wywołaną ciepłem). Po zestaleniu agaru odżywczego płytka jest inkubowana.
Metoda Spread Plate, w której próbkę (w małej objętości) rozprowadza się po powierzchni płytki z agarem odżywczym i pozostawia do wyschnięcia przed inkubacją w celu zliczenia.
Metoda filtra membranowego, w której próbka jest filtrowana przez filtr membranowy, a następnie filtr umieszczany na powierzchni płytki z agarem odżywczym (bakterie do góry). Podczas inkubacji składniki odżywcze przedostają się przez filtr, wspierając rosnące komórki. Ponieważ powierzchnia większości filtrów jest mniejsza niż standardowej szalki Petriego, liniowy zakres liczby płytek będzie mniejszy.
Metody Milesa i Misra lub metoda kroplowej płytki, w której bardzo mała porcja (zwykle około 10 mikrolitrów) próbki z każdego rozcieńczenia w serii jest upuszczana na szalkę Petriego. Naczynie kroplowe należy odczytywać, gdy kolonie są bardzo małe, aby zapobiec utracie CFU podczas ich wspólnego wzrostu. ^{[ potrzebne źródło ]}

Jednak w przypadku technik, które wymagają użycia płytki agarowej, nie można użyć żadnego roztworu płynnego, ponieważ nie można określić czystości próbki i nie można policzyć komórek w płynie jedna po drugiej.

Narzędzia do liczenia kolonii

Tradycyjny sposób liczenia CFU za pomocą „licznika kliknięć” i długopisu. Gdy kolonie są zbyt liczne, powszechną praktyką jest liczenie CFU tylko na ułamku szalki.

Liczenie kolonii tradycyjnie odbywa się ręcznie za pomocą pióra i licznika kliknięć. Jest to na ogół proste zadanie, ale może stać się bardzo pracochłonne i czasochłonne, gdy trzeba policzyć wiele tablic. Alternatywnie można zastosować rozwiązania półautomatyczne (oprogramowanie) i automatyczne (sprzęt + oprogramowanie). ^{[ potrzebne źródło ]}

Oprogramowanie do liczenia CFU

Kolonie można policzyć na podstawie zdjęć płytek za pomocą narzędzi programowych. Eksperymentatorzy na ogół robili zdjęcie każdej płytki, którą musieli policzyć, a następnie analizowali wszystkie zdjęcia (można to zrobić za pomocą prostego aparatu cyfrowego lub nawet kamery internetowej). Ponieważ zrobienie pojedynczego zdjęcia zajmuje mniej niż 10 sekund, w przeciwieństwie do kilku minut ręcznego liczenia CFU, takie podejście generalnie oszczędza dużo czasu. Ponadto jest bardziej obiektywny i umożliwia ekstrakcję innych zmiennych, takich jak wielkość i kolor kolonii.

OpenCFU [1] to darmowy program o otwartym kodzie źródłowym, zaprojektowany w celu optymalizacji łatwości obsługi, szybkości i niezawodności. Oferuje szeroką gamę filtrów i kontroli oraz nowoczesny interfejs użytkownika. OpenCFU jest napisany w C++ i używa OpenCV do analizy obrazu.
NICE to program napisany w MATLAB , który zapewnia łatwy sposób liczenia kolonii z obrazów.
ImageJ i CellProfiler : Niektóre makra i wtyczki ImageJ oraz niektóre potoki CellProfiler mogą być używane do liczenia kolonii. Często wymaga to od użytkownika zmiany kodu w celu osiągnięcia wydajnego przepływu pracy, ale może okazać się przydatne i elastyczne. Jednym z głównych problemów jest brak określonego GUI , który może sprawić, że interakcja z algorytmami przetwarzania będzie nużąca.

Oprócz oprogramowania opartego na tradycyjnych komputerach stacjonarnych dostępne są aplikacje na urządzenia z systemem Android i iOS do półautomatycznego i automatycznego liczenia kolonii. Zintegrowana kamera służy do robienia zdjęć płytki agarowej, a wewnętrzny lub zewnętrzny algorytm jest używany do przetwarzania danych obrazu i szacowania liczby kolonii.

Systemy automatyczne

Wiele zautomatyzowanych systemów jest używanych do przeciwdziałania błędom ludzkim , ponieważ wiele technik badawczych wykonywanych przez ludzi polegających na liczeniu pojedynczych komórek wiąże się z dużym prawdopodobieństwem popełnienia błędu. Ze względu na fakt, że badacze regularnie ręcznie liczą komórki za pomocą światła przechodzącego, ta podatna na błędy technika może mieć znaczący wpływ na obliczone stężenie w głównej płynnej pożywce, gdy komórek jest mało.

Zautomatyzowany licznik kolonii wykorzystujący przetwarzanie obrazu.

Całkowicie zautomatyzowane systemy są również dostępne u niektórych producentów biotechnologicznych. Są na ogół drogie i nie tak elastyczne jak samodzielne oprogramowanie, ponieważ sprzęt i oprogramowanie są zaprojektowane do współpracy w określonej konfiguracji. ^{[ Potrzebne źródło ]} Alternatywnie, niektóre systemy automatyczne wykorzystują paradygmat powlekania spiralnego . ^{[ potrzebne źródło ]}

Niektóre zautomatyzowane systemy, takie jak systemy MATLAB, umożliwiają zliczanie komórek bez konieczności ich barwienia. Pozwala to na ponowne wykorzystanie kolonii do innych eksperymentów bez ryzyka zabicia mikroorganizmów plamami. Jednak wadą tych zautomatyzowanych systemów jest to, że niezwykle trudno jest rozróżnić mikroorganizmy z kurzem lub rysami na płytkach z agarem z krwią, ponieważ zarówno kurz, jak i rysy mogą tworzyć bardzo zróżnicowaną kombinację kształtów i wyglądów.

Jednostki alternatywne

można zastosować parametry Najbardziej prawdopodobna liczba (MPN) i Zmodyfikowane jednostki ryboludzi (MFU) ^{[ potrzebne źródło ] .} Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby umożliwia zliczanie żywotnych komórek i jest przydatna przy zliczaniu niskich stężeń komórek lub zliczaniu drobnoustrojów w produktach, w których cząstki stałe powodują, że liczenie na płytkach jest niepraktyczne. Zmodyfikowane jednostki ryboludzi uwzględniają bakterie, które są zdolne do życia, ale nie nadają się do hodowli. ^{[ potrzebne źródło ]}

Zobacz też

Dalsza lektura

Fishman, William H.; Bernfeld, Piotr (1955). [31] Glukuronidazy . Metody w enzymologii . Tom. 1. s. 262 –9. doi : 10.1016/0076-6879(55)01035-5 . ISBN 978-0-12-181801-2 .