Klonowanie Golden Gate
Klonowanie Golden Gate lub Golden Gate Assembly to metoda klonowania molekularnego , która pozwala naukowcowi na jednoczesne i kierunkowe składanie wielu fragmentów DNA w jeden fragment przy użyciu enzymów restrykcyjnych typu IIS i ligazy DNA T4 . Montaż ten przeprowadza się in vitro . Do najczęściej stosowanych enzymów typu IIS należą BsaI, BsmBI i BbsI.
W przeciwieństwie do standardowych enzymów restrykcyjnych typu II, takich jak EcoRI i BamHI , enzymy te tną DNA poza ich miejscami rozpoznawania i dlatego mogą tworzyć niepalindromiczne nawisy . Ponieważ możliwych jest 256 potencjalnych wystających sekwencji, można złożyć wiele fragmentów DNA, stosując kombinacje wystających sekwencji. W praktyce oznacza to, że klonowanie Golden Gate jest zazwyczaj bez blizn. Ponadto, ponieważ produkt końcowy nie ma miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny typu IIS, prawidłowo zligowany produkt nie może zostać ponownie przecięty przez enzym restrykcyjny, co oznacza, że reakcja jest zasadniczo nieodwracalna.
Typowy protokół termocyklera wielokrotnie oscyluje między 37°C (optymalna dla enzymów restrykcyjnych) a 16°C (optymalna dla ligaz). Chociaż tę technikę można zastosować do pojedynczej wstawki, naukowcy wykorzystali klonowanie Golden Gate do jednoczesnego złożenia wielu fragmentów DNA.
Bezproblemowe klonowanie
Sekwencje blizn są powszechne w wielosegmentowym składaniu DNA. W metodzie składania wielosegmentowego Gateway segmenty są dodawane do dawcy z dodatkowymi sekwencjami att, które nakładają się w tych dodanych segmentach, co skutkuje segmentami oddzielonymi sekwencjami att. W BioBrick między każdym segmentem dodanym do plazmidu pozostaje ośmionukleotydowa sekwencja blizny, która koduje tyrozynę i kodon stop.
Zespół Golden Gate wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS wycinające poza ich rozpoznawanymi sekwencjami. Również ten sam enzym restrykcyjny typu IIS może generować liczne różne wystające fragmenty na wstawkach i wektorze, na przykład BsaI tworzy 256 wystających fragmentów o czterech parach zasad. Jeśli nawisy są starannie zaprojektowane, segmenty są ligowane bez sekwencji blizn między nimi, a końcowy konstrukt może być prawie pozbawiony blizn, w którym miejsca enzymów restrykcyjnych pozostają po obu stronach wstawki. Ponieważ dodatkowe segmenty można wstawiać do wektorów bez blizn w otwartej ramce odczytu , Golden Gate jest szeroko stosowany w inżynierii białek .
Projekt plazmidu
Chociaż klonowanie Golden Gate przyspiesza klonowanie wielosegmentowe, wymagane jest staranne zaprojektowanie plazmidów dawcy i biorcy. Naukowcy z New England Biolabs z powodzeniem zademonstrowali składanie 35 fragmentów za pomocą reakcji Golden Gate Assembly w jednej probówce. Krytyczne dla tej metody składania, szkielet wektora plazmidu docelowego i wszystkie fragmenty składania są flankowane przez miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne typu IIS, ponieważ ten podtyp enzymów restrykcyjnych tnie w dół od ich miejsc rozpoznawania . Po pocięciu, każdy aktywny fragment DNA ma unikalne nawisy, które łączą się z następnym fragmentem DNA w planowanym zespole i ulegają ligacji, budując zespół. Chociaż możliwe jest również, aby nawis zrosił się z powrotem do swojego pierwotnego nawisu komplementarnego związanego z miejscem rozpoznawania w górę i został zligowany, ponownie tworząc pierwotną sekwencję, będzie on podatny na dalsze cięcie podczas reakcji składania.
Standardy klonowania
Zespół DNA enzymu restrykcyjnego ma standardy klonowania, aby zminimalizować zmianę wydajności klonowania i funkcji plazmidu, co może być spowodowane kompatybilnością miejsc restrykcyjnych na wstawce i tych na wektorze.
Standardy klonowania zespołu Golden Gate mają dwa poziomy. Zespół Golden Gate pierwszego poziomu konstruuje konstrukt pojedynczego genu poprzez dodanie elementów genetycznych, takich jak promotor, otwarte ramki odczytu i terminatory. Następnie zespół Golden Gate drugiego poziomu łączy kilka konstrukcji wykonanych w zespole pierwszego poziomu, aby utworzyć konstrukt wielogenowy. Aby osiągnąć montaż drugiego poziomu, stosuje się modułowy system klonowania (MoClo) i standard GoldenBraid 2.0.
System MoClo
Modular Cloning, czyli MoClo, to metoda składania wprowadzona w 2011 roku przez Ernsta Webera i wsp., w której za pomocą miejsc restrykcyjnych typu IIS użytkownik może zligować ze sobą co najmniej sześć części DNA w szkielet w reakcji w jednym naczyniu. Jest to metoda oparta na Golden Gate Assembly, gdzie enzymy restrykcyjne typu IIS rozszczepiają się poza miejscem rozpoznawania na jedną stronę, co pozwala na usunięcie tych miejsc restrykcyjnych z projektu. Pomaga to wyeliminować nadmierne tworzenie się par zasad lub blizn między częściami DNA. Jednak w celu prawidłowej ligacji, MoClo wykorzystuje zestaw miejsc fuzji o 4 parach zasad, które pozostają między częściami po ligacji, tworząc blizny o 4 parach zasad między częściami DNA w końcowej sekwencji DNA po ligacji dwóch lub więcej części.
MoClo wykorzystuje podejście równoległe, w którym wszystkie konstrukty z poziomu pierwszego (moduły poziomu 0) mają miejsca restrykcyjne dla BpiI po obu stronach wstawek. Wektor (znany również jako „wektor docelowy”), do którego zostaną dodane geny, ma skierowane na zewnątrz miejsce restrykcyjne BsaI z kasetą skriningową typu drop-out. LacZ jest powszechną kasetą przesiewową, w której jest zastępowany konstruktem wielogenowym wektora docelowego. Każdy konstrukt poziomu pierwszego i wektor mają na sobie różne nawisy, ale są one komplementarne do nawisu następnego segmentu, a to określa układ ostatecznego konstruktu wielogenowego. Klonowanie Golden Gate zwykle zaczyna się od modułów poziomu 0. Jeśli jednak moduł poziomu 0 jest zbyt duży, klonowanie rozpocznie się od fragmentów poziomu -1, które należy zsekwencjonować, aby pomóc w sklonowaniu dużego konstruktu. Jeśli zaczyna się od fragmentów poziomu -1, moduły poziomu 0 nie muszą być ponownie sekwencjonowane, natomiast jeśli zaczyna się od modułów poziomu 0, moduły muszą być sekwencjonowane.
Moduły poziomu 0
Moduły poziomu 0 są podstawą systemu MoClo, gdzie zawierają elementy genetyczne, takie jak promotor, nieulegający translacji region 5' (UTR), sekwencję kodującą i terminator. Dla celów klonowania Golden Gate, wewnętrzne sekwencje modułów poziomu 0 nie powinny zawierać miejsc restrykcyjnych typu IIS dla BsaI, BpiI i Esp3I, gdy są otoczone dwoma miejscami restrykcyjnymi BsaI w odwróconej orientacji. Moduły poziomu 0 bez miejsc ograniczających typu IIS mogą dodawać miejsca BsaI podczas procesu klonowania Golden Gate.
Jeśli moduły poziomu 0 zawierają jakiekolwiek niepożądane miejsce restrykcyjne, można je zmutować in silico przez usunięcie jednego nukleotydu z miejsca restrykcyjnego typu IIS. W procesie tym należy upewnić się, że wprowadzona mutacja nie wpłynie na funkcję genetyczną zakodowaną przez interesującą nas sekwencję. Preferowana jest cicha mutacja w sekwencji kodującej, ponieważ nie zmienia ona sekwencji białka ani funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Fragmenty poziomu -1
Fragmenty poziomu -1 są używane do klonowania dużych modułów poziomu 0. W celu sklonowania fragmentów poziomu -1 można zastosować klonowanie na tępe końce z ligacją restrykcyjną. Wektor użyty do klonowania fragmentów poziomu -1 nie może zawierać miejsca restrykcyjnego BpiI typu IIS, które stosuje się w następnym etapie składania. Ponadto wektor powinien również mieć inny marker selekcyjny niż wektor docelowy w następnym etapie składania, na przykład, jeśli w modułach poziomu 0 stosowana jest oporność na spektynomycynę, fragmenty poziomu -1 powinny mieć inną oporność na antybiotyk, taką jak ampicylina.
Konstrukcje poziomu 1
Wektor docelowy poziomu 1 określa pozycję i orientację każdego genu w końcowym konstrukcie. Dostępnych jest czternaście wektorów poziomu 1, które różnią się jedynie sekwencją flankujących miejsc fuzji, podczas gdy są identyczne w wewnętrznych miejscach fuzji. Stąd wszystkie wektory mogą składać się z tych samych części poziomu 0.
Ponieważ wszystkie wektory poziomu 1 są plazmidami binarnymi, stosuje się je do tymczasowej ekspresji w roślinach za pośrednictwem Agrobacterium .
Konstrukcje poziomu 2
Wektory poziomu 2 mają dwa odwrócone miejsca BpiI po wstawieniu modułów poziomu 1. Górne miejsce fuzji jest zgodne z genem sklonowanym w wektorze poziomu 1, podczas gdy niższe miejsce fuzji ma uniwersalną sekwencję. Każde klonowanie pozwala na wstawienie 2-6 genów do tego samego wektora.
Nie zaleca się dodawania większej liczby genów w jednym etapie klonowania, ponieważ spowodowałoby to powstanie nieprawidłowych konstruktów. Z jednej strony może to indukować więcej miejsc restrykcyjnych w konstrukcie, gdzie ten otwarty konstrukt umożliwia dodanie dodatkowych genów. Z drugiej strony może to również wyeliminować miejsca restrykcyjne, w których ten bliski konstrukt zatrzymuje dalsze dodawanie genów.
Dlatego konstrukty zawierające więcej niż sześć genów wymagają kolejnych etapów klonowania, co wymaga łączników końcowych zawierających wewnętrzne miejsca restrykcyjne BsaI lub BsmBI oraz niebieskie lub fioletowe markery. Każdy etap klonowania wymaga zamiany miejsca restrykcyjnego i markera. Ponadto potrzebne są dwa enzymy restrykcyjne, przy czym BpiI jest używany do uwalniania modułów poziomu 1 z konstruktów poziomu 1, a BsaI/BsmBI służy do trawienia i otwierania plazmidu poziomu 2-n biorcy. Podczas badania przesiewowego prawidłowe kolonie powinny zmieniać kolor z niebieskiego na fioletowy na każdym etapie klonowania, ale jeśli używany jest „zamknięty” łącznik końcowy, kolonie będą białe.
Konstrukcje poziomu M
Wektory poziomu M są podobne do wektorów poziomu 2, ale mają miejsce BsaI zlokalizowane powyżej dwóch odwróconych miejsc BpiI. Kiedy jeden lub kilka genów jest sklonowanych w wektorze poziomu M, drugi BsaI jest dodawany na końcu konstruktu poprzez łącznik końcowy poziomu M (ref.). Pozwala to na wycięcie fragmentu zawierającego wszystkie złożone geny z wektora i subklonowanie na kolejnym poziomie klonowania (poziom P).
Konstrukcje poziomu P
Wektory poziomu P są podobne do konstruktów poziomu M, z wyjątkiem tego, że miejsca Bpil są zastąpione miejscami BsaI, a miejsca BsaI są zastąpione miejscami BpiI. Kilka konstruktów poziomu M z kompatybilnymi miejscami fuzji można subklonować do wektora poziomu P w jednym etapie. Teoretycznie aż 36 genów można złożyć w jeden konstrukt przy użyciu 6 równoległych reakcji poziomu M (każda wymagana do złożenia 6 genów na konstrukt poziomu M), po których następuje jedna końcowa reakcja poziomu P. W praktyce zwykle składa się mniej genów, ponieważ większość projektów klonowania nie wymaga tak wielu genów. Strukturę wektorów poziomu M i P zaprojektowano w taki sposób, że geny sklonowane w konstruktach poziomu P można dalej składać w wektorach poziomu M. Powtarzane klonowanie w wektorach poziomu M i P tworzy pętlę, którą można powtarzać w nieskończoność, aby złożyć stopniowo duże konstrukty.
Złoty warkocz
W standardowym klonowaniu Golden Gate, miejsc restrykcyjnych z poprzedniego konstruktu poziomu nie można ponownie wykorzystać. Aby dodać więcej genów do konstruktu, do wektora docelowego należy dodać miejsca restrykcyjne innego enzymu restrykcyjnego typu IIS. Można to zrobić za pomocą poziomu 2 lub M i P. Wariantowa wersja poziomu M i P jest również dostarczana przez GoldenBraid.
GoldenBraid rozwiązuje problem projektowania wielu wektorów docelowych, mając podwójną pętlę, która jest „warkoczem”, aby umożliwić binarne składanie wielu konstrukcji. Istnieją dwa poziomy docelowych plazmidów, poziom α i poziom Ω. Każdy poziom plazmidów można wielokrotnie stosować jako plazmidy wejściowe dla innego poziomu plazmidów, ponieważ oba poziomy plazmidów mają różne miejsca restrykcyjne typu IIS, które są w odwróconej orientacji. W przypadku kontrselekcji dwa poziomy plazmidów różnią się markerami oporności na antybiotyki.
Złota mutageneza
Zasadę klonowania Golden Gate można również zastosować do przeprowadzenia mutagenezy określanej jako Golden Mutagenesis. Technologia jest łatwa do wdrożenia, ponieważ dostępne jest narzędzie internetowe do projektowania starterów ( https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/ ), a wektory są zdeponowane w addgene ( http://www.addgene.org/browse /artykuł/28196591/ ).
Nazwa
Nazwa Golden Gate Assembly pochodzi od propozycji Jurija Gleby. Z jednej strony nawiązywać będzie do Technologii Gateway , z drugiej obrazować z większą precyzją mostu płynnie łączącego ulice dwóch brzegów. Jednym z najbardziej znanych mostów jest most Golden Gate w San Francisco .