Technologia bramki

Metoda klonowania Gateway , wynaleziona i wprowadzona na rynek przez firmę Invitrogen od późnych lat 90., jest metodą klonowania reakcji rekombinacji integracji i wycinania, które mają miejsce, gdy bakteriofag lambda zakaża bakterie. Ta technologia zapewnia szybki i wysoce wydajny sposób transportu sekwencji DNA do systemów wielowektorowych w celu analizy funkcjonalnej i ekspresji białek przy użyciu miejsc Gateway att oraz dwóch zastrzeżonych mieszanek enzymów o nazwach BP Clonase i LR Clonase. In vivo te reakcje rekombinacji są ułatwione przez rekombinację miejsc przyłączania z chromosomu lambda/faga (attP) i bakterii (attB). W wyniku rekombinacji między miejscami attP i attB, fag integruje się z genomem bakteryjnym otoczonym przez dwa nowe miejsca rekombinacji (attLeft i attRight). Usunięcie faga z chromosomu bakteryjnego i regeneracja miejsc attP i attB mogą wynikać z rekombinacji miejsc attL i attR w określonych okolicznościach.

Sekwencje DNA do klonowania dodaje się do zmodyfikowanych wersji tych specjalnych miejsc Gateway Att. Zachodzą dwie reakcje enzymatyczne, klonaza BP i klonaza LR. Klonaza BP zachodzi pomiędzy miejscami attB otaczającymi wstawkę i miejscami attP wektora donorowego. Ta reakcja jest katalizowana przez mieszaninę enzymów BP Clonase i daje klon wejściowy zawierający interesujące DNA otoczone domenami attL. Jako produkt uboczny reakcji, gen ccdB jest wycinany z wektora dawcy. Klonaza LR występuje pomiędzy regionami attL wygenerowanego klonu wejściowego i regionami attR wektora docelowego i jest katalizowana przez mieszankę enzymów klonazy LR. W rezultacie powstaje klon ekspresyjny z DNA będącym przedmiotem zainteresowania otoczonym regionami attB. Podobnie jak w reakcji BP, sekwencja DNA zawierająca gen ccdB jest wycinana z wektora docelowego.

Duże archiwa klonów Gateway Entry, zawierające ogromną większość ludzkich, mysich i szczurzych ORF ( otwarte ramki odczytu ) zostały sklonowane z ludzkich bibliotek cDNA lub zsyntetyzowane chemicznie w celu wsparcia społeczności badawczej przy użyciu funduszy NIH (National Institutes of Health) (np. Kolekcja genów ssaków, http://mgc.nci.nih.gov/ ). Dostępność tych kaset genowych w standardowym plazmidzie do klonowania Gateway pomaga naukowcom szybko przenieść te kasety do plazmidów, które ułatwiają analizę funkcji genów. Klonowanie bramy zajmuje więcej czasu na wstępną konfigurację i jest droższe niż tradycyjne metody klonowania oparte na enzymach restrykcyjnych i ligazach, ale oszczędza czas i oferuje prostsze i wysoce wydajne klonowanie do dalszych zastosowań.

Technologia ta została szeroko przyjęta przez środowisko naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi, zwłaszcza w zastosowaniach wymagających przeniesienia tysięcy fragmentów DNA do jednego typu plazmidu (np. zawierającego promotor CMV do ekspresji białka w komórkach ssaków) lub do przeniesienia jednego fragmentu DNA na wiele różnych typów plazmidów (np. do ekspresji białek bakteryjnych, owadów i ssaków).

Podstawowe kroki klonowania

Pierwszym krokiem w klonowaniu Gateway jest przygotowanie klonu Gateway Entry. Istnieje kilka różnych sposobów tworzenia klonów wpisów.

  1. Sekwencje bramkowe attB1 i attB2 dodaje się odpowiednio do końca 5' i 3' fragmentu genu, stosując specyficzne dla genu startery PCR i amplifikację PCR. Produkty amplifikacji PCR miesza się następnie z zastrzeżoną mieszaniną plazmidów zwanych „wektorami donorowymi Gateway” (terminologia firmy Invitrogen) i zastrzeżonymi enzymami „BP Clonase”. Mieszanka enzymów katalizuje rekombinację i insercję produktu PCR zawierającego sekwencję attB w miejsca rekombinacji attP w wektorze Gateway Donor. Gdy kaseta jest częścią plazmidu docelowego, jest określana jako „klon wejściowy” w nomenklaturze Gateway, a sekwencje rekombinacyjne są określane jako typ Gateway „attL”.
  2. Krótki koniec zawierający attL jest dodawany przy użyciu metody TOPO, techniki, w której fragmenty DNA są klonowane do określonych wektorów bez potrzeby stosowania ligaz DNA.
  3. Żądaną sekwencję DNA można wklonować w miejsce multiklonowania zawierające attL przy użyciu enzymu restrykcyjnego.

Drugim krokiem w klonowaniu Gateway jest przygotowanie klonu Gateway Expression. Ważne jest, aby podczas przygotowywania klonu ekspresyjnego wybrać wektor docelowy, który najlepiej pasuje do celu. Kasetę genową w klonie Gateway Entry można następnie łatwo i skutecznie przenieść do dowolnego wektora Gateway Destination (nomenklatura Invitrogen dla dowolnego plazmidu Gateway, który zawiera sekwencje rekombinacyjne Gateway „attR” i elementy, takie jak promotory i znaczniki epitopowe, ale nie ORF) przy użyciu zastrzeżona mieszanka enzymów „LR Clonase”. Stworzono tysiące plazmidów Gateway Destination, które są swobodnie udostępniane badaczom na całym świecie. Wektory Gateway Destination są podobne do klasycznych wektorów ekspresyjnych zawierających wiele miejsc klonowania, przed wstawieniem interesującego genu, przy użyciu trawienia enzymami restrykcyjnymi i ligacji. Wektory Gateway Destination są dostępne w handlu z Invitrogen, EMD ( Novagen ) i Covalys.

Trzecim krokiem w klonowaniu Gateway jest przygotowanie interesującego Cię genu. Upewnij się, że używasz sekwencjonowania lub skrótu restrykcyjnego, aby sprawdzić integralność klonu ekspresji. Gdy twój konstrukt zadziała, możesz transformować lub transfekować komórki, które zamierzasz wykorzystać w swoich badaniach.

Ponieważ klonowanie Gateway wykorzystuje opatentowane sekwencje rekombinacyjne i zastrzeżone mieszanki enzymów dostępne tylko w firmie Invitrogen, technologia ta nie pozwala naukowcom na zmianę dostawców i przyczynia się do efektu blokady wszystkich takich opatentowanych procedur.

Podsumowując różne kroki związane z klonowaniem bramy:

  • reakcja Gateway BP: produkt PCR z flankującymi miejscami att B (w tym etapie można również wykorzystać inne metody izolacji DNA, takie jak trawienie restrykcyjne) + wektor donorowy zawierający miejsca attP + klonaza BP => klon Gateway Entry, zawierający miejsca att L, będący przedmiotem zainteresowania gen flankujący
  • Reakcja Gateway LR: klon wejściowy zawierający miejsca att L + wektor docelowy zawierający miejsca att R oraz promotory i znaczniki + klonaza LR => klon ekspresyjny zawierający miejsca attB, interesujący gen flankujący, gotowy do ekspresji genów.

Zalety metody klonowania Gateway

Elastyczność

Twoja interesująca sekwencja DNA może zostać przeniesiona przez dowolny system ekspresyjny w jednym etapie rekombinacji, kiedy tworzysz z nią klon wejściowy.

Prędkość

Zamiast zabierać dwa lub więcej dni z konwencjonalnym klonowaniem restrykcyjnym i ligacyjnym, podejście Gateway pozwala na stworzenie konstruktu ekspresyjnego w zaledwie jeden dzień. Produkty attB-PCR można również natychmiast sklonować do wektorów docelowych, przeprowadzając reakcje BP i LR w tej samej probówce. Nie ma procedur restrykcji, ligacji lub oczyszczania na żelu podczas procesu klonowania.

Klonowanie wielu fragmentów

Klonowanie przez bramkę można wykorzystać do jednoczesnego wstawienia kilku fragmentów DNA do wielu wektorów w jednej probówce. Aby stworzyć niezbędny klon ekspresyjny, do jednego wektora Gateway można sklonować do czterech segmentów DNA w precyzyjnej kolejności i orientacji w pojedynczej probówce. Umożliwia to konstrukcja wektorów Gateway.

Wysoka wydajność

Metoda klonowania bramy wykorzystuje pozytywne i negatywne markery selekcyjne, aby zwiększyć szansę na pomyślne sklonowanie genu. Oznacza to, że proces jest bardziej wydajny, co oznacza większe prawdopodobieństwo uzyskania pomyślnych wyników.

Uniwersalność

Wszystkie typy fragmentów DNA można klonować przy użyciu technik PCR. Klonowanie jest dostępne dla wielu różnych rodzajów organizmów, od ssaków po bakterie.

Zobacz też

  • [1]
  •    Hartley JL, Temple GF, Brasch MA (listopad 2000). „Klonowanie DNA przy użyciu rekombinacji specyficznej dla miejsca in vitro” . Genom Res . 10 (11): 1788–95. doi : 10.1101/gr.143000 . PMC 310948 . PMID 11076863 .
  •    Katzen F (kwiecień 2007). „Klonowanie rekombinacyjne Gateway (®): biologiczny system operacyjny”. Opinia eksperta Lek Discov . 2 (4): 571–89. doi : 10.1517/17460441.2.4.571 . PMID 23484762 . S2CID 22606399 .
  •   Freuler F, Stettler T, Meyerhofer M, Leder L, Mayr LM (czerwiec 2008). „Opracowanie nowatorskiego systemu wektorów opartego na bramce do wydajnej, wielorównoległej ekspresji białek w Escherichia coli”. Eksp. białka Purif . 59 (2): 232–41. doi : 10.1016/j.pep.2008.02.003 . PMID 18375142 .
  • Hartley JL. Wykorzystanie systemu bramek do ekspresji białek w wielu hostach. Curr Protoc Protein Sci. Luty 2003; Rozdział 5: Część 5.17. PubMed PMID:18429245 .
  • Ptaszne, M. (1992). Przełącznik genetyczny: fag (lambda) i organizmy wyższe (Cambridge, MA: Cell Press).
Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Gateway_Technology&oldid=1137188229 ”